污(wu)染(ran)是細(xi)胞培養的大敵。預防(fang)和避免污(wu)染(ran)是細(xi)胞培養成(cheng)功(gong)的關鍵之一。一開(kai)始就(jiu)要十分重視，防(fang)止(zhi)污(wu)染(ran)，否則會前(qian)功(gong)盡(jin)棄(qi)，不僅浪(lang)費時間，而且浪(lang)費人力(li)、物力(li)，甚(shen)至造成(cheng)無法彌補的損失(shi)。

　　(一)污染的類型

　　細胞(bao)(bao)培(pei)養過程中的(de)污染不僅(jin)僅(jin)指(zhi)微生物，而且還包(bao)括所有混(hun)入培(pei)養環境中的(de)、對(dui)細胞(bao)(bao)生存有害或(huo)造(zao)成(cheng)細胞(bao)(bao)不純的(de)物質(zhi)，包(bao)括生物和化(hua)學物質(zhi)。

　　1、細菌污染

　　細菌(jun)(jun)(jun)污(wu)染是實驗室細胞培養中常見的污(wu)染，即使在細胞培養液中加入了抗(kang)菌(jun)(jun)(jun)素，也可能(neng)因為操作不慎而(er)引起污(wu)染。最常見的有革(ge)(ge)蘭氏(shi)陽(yang)性菌(jun)(jun)(jun)，如枯草桿菌(jun)(jun)(jun)以及大腸桿菌(jun)(jun)(jun)、假單胞菌(jun)(jun)(jun)等(deng)革(ge)(ge)蘭氏(shi)陰性菌(jun)(jun)(jun)，其中又以白色(se)葡萄球菌(jun)(jun)(jun)較常見。

　　培養細(xi)胞(bao)受細(xi)菌污(wu)染后，會出現培養液變(bian)(bian)混濁，pH改變(bian)(bian)。污(wu)染后細(xi)胞(bao)發生病理改變(bian)(bian)，胞(bao)內顆(ke)粒(li)增多、增粗，最后變(bian)(bian)圓脫落死(si)亡(wang)。

　　2、真菌污染(ran)

　　真菌(jun)(jun)污染(ran)是細胞培(pei)養過程中最(zui)常見的一種(zhong)，最(zui)常見的真菌(jun)(jun)有煙曲(qu)霉、黑曲(qu)菌(jun)(jun)、孔子(zi)霉、毛霉菌(jun)(jun)、白色(se)念(nian)珠菌(jun)(jun)和(he)酵母菌(jun)(jun)。

　　培(pei)(pei)養細(xi)(xi)胞受(shou)真菌污染后，可見培(pei)(pei)養液中漂浮著白色或(huo)淺黃色的(de)小點，有的(de)散(san)在生(sheng)長，培(pei)(pei)養液一般不(bu)發生(sheng)混濁;倒置(zhi)顯(xian)微鏡下可見絲(si)狀、管狀或(huo)樹枝狀的(de)菌絲(si)縱橫(heng)交(jiao)錯在細(xi)(xi)胞之間(jian)或(huo)培(pei)(pei)養基中，有的(de)呈鏈狀排列。

　　真菌污(wu)染(ran)后，細胞生(sheng)長變慢，但(dan)最(zui)后由(you)于營養耗(hao)盡及毒性作用(yong)而使細胞脫落死(si)亡。

　　

絲狀菌污染

　　3、支原體污(wu)染

　　支原體是介于細菌(jun)與(yu)病(bing)毒之(zhi)間能獨立生(sheng)活的(de)最小(xiao)(xiao)微生(sheng)物，最小(xiao)(xiao)直徑0.2μm，一般過濾(lv)除菌(jun)無法去除它(ta)，光鏡下難以看(kan)清它(ta)的(de)形態(tai)結(jie)構。開始不易發現(xian)，能在偏堿條(tiao)件下生(sheng)存，對青(qing)霉素有抗藥性。多吸附(fu)于細胞(bao)表面(mian)或散在于細胞(bao)之(zhi)間。

　　培養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)受(shou)支原體污(wu)染(ran)后，部分(fen)敏感細(xi)(xi)胞(bao)可見細(xi)(xi)胞(bao)生長增殖變慢，部分(fen)細(xi)(xi)胞(bao)變圓(yuan)，從瓶(ping)壁脫落。但多數細(xi)(xi)胞(bao)污(wu)染(ran)后無明顯變化，或略有變化，若(ruo)不及時處(chu)理，還(huan)會產生交叉污(wu)染(ran)。

    

陽性   ;                 陰(yin)性

　　4、病毒污染

　　組織細胞培養(yang)過程(cheng)中(zhong)，如果沒有除去(qu)潛在的病毒，就會產生病毒污染。目(mu)前，從原代(dai)猴腎(shen)細胞的培養(yang)中(zhong)已發(fa)現不(bu)少于20種血清性病毒。

　　盡管病毒(du)污染的細胞不影響(xiang)原代培養(yang)，但(dan)生(sheng)產疫(yi)苗是不安全的。因此(ci)，潛在病毒(du)是細胞大(da)量生(sheng)產和(he)疫(yi)苗、干擾素等(deng)生(sheng)物制品制作中的難題。

　　5、非同種細胞污(wu)染

　　由于(yu)細(xi)胞培養(yang)操作時(shi)各細(xi)胞株(zhu)所(suo)需的器材和溶(rong)液沒(mei)有(you)嚴格分開，往往會使(shi)一種(zhong)(zhong)細(xi)胞被另(ling)一種(zhong)(zhong)細(xi)胞污(wu)染。目前，世(shi)界(jie)上(shang)已有(you)幾十種(zhong)(zhong)細(xi)胞都被HeLa細(xi)胞所(suo)污(wu)染，致使(shi)許(xu)多實驗宣告無效。

　　非(fei)細胞培(pei)養物所(suo)造成的(de)化學成分的(de)污染也偶有發生，大(da)多是由于細胞培(pei)養所(suo)需物品清(qing)洗消毒不(bu)徹底而(er)帶入一些有毒化學物質所(suo)致。

　　(二)污染的鑒別

　　1、細(xi)菌、真菌污染(ran)的檢測(ce)

　　(1)肉眼觀(guan)察

　　細(xi)菌、真菌污染(ran)常在傳代、換液、加樣等開放(fang)性操作之后發生，而且增(zeng)生迅速，若有污染(ran)，在48小(xiao)時(shi)內可明(ming)顯觀察到，例如(ru)培(pei)養(yang)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮(fu)物漂起。

　　(2)接(jie)種觀(guan)察

 　　采用普通肉湯接(jie)種(zhong)或用未加雙抗藥(yao)物的培養(yang)液(ye)接(jie)種(zhong)，也可發現是(shi)否有污染。

　　(3)鏡下觀察

　　在倒置顯微鏡(jing)的高倍鏡(jing)下(xia)可見培養液中有大量圓(yuan)球狀(zhuang)顆粒漂(piao)浮，即為細菌污染(ran)。

　　若細(xi)胞之間有絲狀、管狀、樹枝(zhi)狀或卵形(xing)的(de)物質常為(wei)真菌污(wu)染。

　　2、支原(yuan)體污染的檢測

　　(1)相差顯微(wei)鏡觀(guan)察

　　直接取少(shao)許培養液滴在載物片上，再蓋(gai)上蓋(gai)片觀察，支原(yuan)體在鏡下呈暗(an)色微小顆粒，多位(wei)于(yu)細(xi)胞(bao)與細(xi)胞(bao)之間(jian)，有時可見類似于(yu)布朗運(yun)動的(de)表現(xian)。應注意(yi)與細(xi)胞(bao)破(po)碎溢出的(de)內容物如線粒體等相區別(bie)。

　　(2)熒光染色法(fa)觀察

　　用熒光染(ran)料(liao)Hoechst33258，此染(ran)料(liao)能(neng)與DNA特(te)異地(di)結(jie)合，可(ke)使(shi)支原(yuan)體(ti)內(nei)的DNA著(zhu)色，熒光顯微鏡下支原(yuan)體(ti)呈綠色小點，散在(zai)于細(xi)胞周圍(wei)或附(fu)于細(xi)胞表(biao)面。

　　(3)電鏡檢(jian)測

　　若條件許可(ke)，可(ke)用掃(sao)描電鏡或(huo)透射電鏡觀察。一(yi)般在細(xi)(xi)胞(bao)培養48～72小時(shi)，細(xi)(xi)胞(bao)接近匯合前，用胰酶消化細(xi)(xi)胞(bao)制成細(xi)(xi)胞(bao)懸液(ye)后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。

　　

支(zhi)原體(ti)掃描(miao)電鏡圖片

　　(4)培(pei)養檢測(ce)

　　將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yang)基(ji)(ji)，培養(yang)14天后觀察(cha)肉湯培養(yang)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yang)基(ji)(ji)中，再用瓊脂培養(yang)基(ji)(ji)做(zuo)分離培養(yang)，37℃培養(yang)3天觀察(cha)有無“荷包(bao)蛋”菌落出現。

　　3 、病毒的檢測

　　1) 應用電鏡技術快速診斷(duan)動(dong)物(wu)病毒病

　　

冠狀病毒電(dian)鏡圖

 　　2) 逆轉(zhuan)錄_聚合酶鏈反(fan)應(ying)RT_PCR檢測(ce)病毒

　　(三)污染的清除

　　培(pei)養(yang)細胞(bao)一經污染(ran)，多數較(jiao)難(nan)處(chu)理。如果污染(ran)細胞(bao)價值(zhi)不大，宜棄之(zhi);在(zai)尋找原因(yin)后(hou)徹底消毒操作室(shi)，復蘇或(huo)重新(xin)購置細胞(bao)，再培(pei)養(yang)。

　　若(ruo)污(wu)染細(xi)胞價值較大，又難于重新得到，可(ke)采(cai)取以下辦法(fa)清(qing)除。

　　一、細菌(jun)和(he)真(zhen)菌(jun)的清(qing)除(chu)

　　1、使用抗生素

　　抗生素對(dui)殺滅細菌較有(you)效(xiao)。聯合用(yong)(yong)藥(yao)(yao)比單(dan)獨用(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果好(hao)。預(yu)防(fang)用(yong)(yong)藥(yao)(yao)比污(wu)染后再用(yong)(yong)藥(yao)(yao)效(xiao)果好(hao)。預(yu)防(fang)用(yong)(yong)藥(yao)(yao)一般用(yong)(yong)雙抗生素，污(wu)染后清除用(yong)(yong)藥(yao)(yao)需(xu)采用(yong)(yong)大于(yu)常用(yong)(yong)量5～10倍的沖洗法(fa)，于(yu)加藥(yao)(yao)后作用(yong)(yong)24～48小時，再換常規培養(yang)液。此法(fa)在(zai)污(wu)染早期有(you)效(xiao)。

　　二、支(zhi)原體的(de)清除

　　1、用MRA處理

　　用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處(chu)理細胞，每4天換一次液,連續處(chu)理15天以確保(bao)細胞純潔健康(kang)，效果好.

　　2、用清洗(xi)純化法清除支原體污染的方法

　　細(xi)(xi)(xi)胞營養馴化→優質(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞群(qun)的篩(shai)選→細(xi)(xi)(xi)胞清洗→反復(fu)離心洗滌

　　其原(yuan)理(li)是利用離(li)心力、細胞(bao)、微生物質量和懸液(ye)的(de)浮力差達到清(qing)除支(zhi)(zhi)原(yuan)體(ti)的(de)目(mu)的(de)。由(you)于(yu)支(zhi)(zhi)原(yuan)體(ti)個體(ti)小且除發(fa)酵支(zhi)(zhi)原(yuan)體(ti)外多為(wei)細胞(bao)外寄生,所(suo)以通過反復(fu)洗滌細胞(bao)和低速離(li)心換液(ye)使其中潛在(zai)的(de)支(zhi)(zhi)原(yuan)體(ti)數量降低至(zhi)極限。

　　如結合(he)敏感抗生素(su)的(de)抑殺(sha)作(zuo)用，可達到更好的(de)效果。

　　3、藥(yao)物輔助加溫處理

　　先用藥物處理后(hou)，再將污染(ran)的組織培養物放在41℃培養18小時，可(ke)殺死支原體，但對細(xi)胞(bao)有不良(liang)影響。

　　4、使用支原體特(te)異性血(xue)清

　　用5%的兔支(zhi)原體免疫血(xue)(xue)清可去除支(zhi)原體污染，因特(te)異抗體可抑制(zhi)支(zhi)原體生長，故經(jing)抗血(xue)(xue)清處理后11天即(ji)轉(zhuan)為(wei)陰性(xing)，并(bing)且5個月后仍為(wei)陰性(xing)。但此(ci)法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jing)濟(ji)。

　　(四)、污染的預防

　　預(yu)防(fang)是(shi)防(fang)止細胞(bao)培養過程中發(fa)生污染的最好辦法。只有(you)預(yu)防(fang)工作做在前，才(cai)能(neng)將(jiang)發(fa)生污染的可能(neng)性降到最小程度。

　　一般預防可從(cong)以下幾方面著(zhu)手：

　　1、添加抗生素(su)

　　2、從物品(pin)、用品(pin)消毒滅菌著手

　　細胞培養所用(yong)物品清洗、消毒(du)要(yao)徹底(di)，各種溶液滅菌除菌要(yao)仔細，并(bing)在無菌試(shi)驗陰性后(hou)才能使用(yong)。

　　操作室及剩(sheng)余的無菌器材要(yao)定期清(qing)潔消(xiao)毒滅菌。

　　3、從操作者做起

　　(1)進無(wu)菌室前要(yao)用肥(fei)皂洗手(shou)，按規定(ding)穿隔離衣。工作開始要(yao)先用75%酒精(jing)棉球擦手(shou)、擦瓶口(kou)和燒灼瓶口(kou)。

 　　(2)操作(zuo)者(zhe)動(dong)(dong)作(zuo)要輕，必須在(zai)火焰周圍無菌區內打(da)開瓶口(kou)，并將瓶口(kou)轉動(dong)(dong)燒(shao)灼。操作(zuo)時盡量不(bu)要談話(hua)，若打(da)噴嚏或咳(ke)嗽應轉向(xiang)背面。

　　(3)操作時(shi)要(yao)常更換吸(xi)管，一旦發現吸(xi)管口接觸了手和其他污染物品(pin)應棄(qi)去。實(shi)驗(yan)完畢用消毒水浸泡(pao)的紗布擦臺(tai)面(mian)。

　　4、防止細胞交(jiao)叉污(wu)染

　　在進(jin)行多種(zhong)細胞培養操作時，所(suo)用(yong)器具要嚴格區(qu)分。

　　在進行換(huan)液或傳代操作時，注(zhu)射器和滴(di)管不(bu)要觸及細胞培(pei)養(yang)瓶瓶口，以免把細胞帶(dai)到培(pei)養(yang)液中污染其他細胞。

　　細(xi)胞(bao)一(yi)旦(dan)(dan)購置或從(cong)別(bie)處引入，均應(ying)及早留種凍存(cun)，一(yi)旦(dan)(dan)發(fa)生(sheng)污染可重新復蘇培養。

　　5、無菌(jun)室的徹底消毒

　　1) 0.1%新潔爾滅(mie)全面(mian)徹底擦洗無菌室;

　　2)甲(jia)醛(quan)熏蒸法：甲(jia)醛(quan)是一種廣譜(pu)滅(mie)菌劑(ji)菌，其(qi)水溶液(ye)和氣休對各(ge)種細菌、芽(ya)孢及真菌等(deng)微生物均(jun)有殺滅(mie)作(zuo)用。