質譜技術在醫學實驗室檢驗中的多種作用
2018-08-10
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由(you)于(yu)(yu)質譜技術(shu)的(de)(de)高特異性(xing)(xing)、高靈敏度、單次分析的(de)(de)快速性(xing)(xing)與檢測信息(xi)的(de)(de)豐富性(xing)(xing)，以及對復(fu)雜生物基質分析的(de)(de)高耐受性(xing)(xing)等特點，臨床(chuang)研究(jiu)和(he)診斷工作也逐漸倚重(zhong)于(yu)(yu)此類重(zhong)要的(de)(de)新型檢測技術(shu)。如：質譜技術(shu)所(suo)能提(ti)供的(de)(de)豐富的(de)(de)檢測信息(xi)，有助于(yu)(yu)臨床(chuang)更(geng)(geng)加完(wan)整地(di)了解疾病和(he)病理狀態，從而為患者提(ti)供更(geng)(geng)為全面和(he)準(zhun)確的(de)(de)診療(liao)服務。
在美國等發(fa)達國家(jia)，質譜(pu)技術(shu)已廣(guang)泛應(ying)用(yong)于(yu)醫學(xue)檢(jian)驗(yan)，基(ji)于(yu)該(gai)技術(shu)開(kai)發(fa)出的臨(lin)床檢(jian)測(ce)(ce)(ce)項目(mu)(mu)已有數百項，但我國目(mu)(mu)前仍(reng)處于(yu)起步階段，檢(jian)測(ce)(ce)(ce)項目(mu)(mu)有70余項;應(ying)用(yong)覆蓋(gai)面非常(chang)廣(guang)泛，涵(han)蓋(gai)了罕見和高難度(du)分(fen)析，包括微(wei)生物鑒定、生化(hua)檢(jian)驗(yan)(激素(su)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)、藥物濃度(du)監測(ce)(ce)(ce)、遺傳(chuan)性疾(ji)病檢(jian)測(ce)(ce)(ce)、營養素(su)檢(jian)測(ce)(ce)(ce)等) 和分(fen)子生物診斷 (蛋(dan)白(bai)組(zu)學(xue)、核(he)苷酸(suan)多態性、代謝(xie)組(zu)學(xue)) [1-5];應(ying)用(yong)范(fan)圍(wei)也在逐步擴展(zhan)，從生化(hua)檢(jian)驗(yan)、微(wei)生物鑒定，到代謝(xie)組(zu)學(xue)、脂質組(zu)學(xue)、蛋(dan)白(bai)組(zu)學(xue)，再(zai)到參考測(ce)(ce)(ce)量(liang)程序的建(jian)立和校準品賦值，乃至術(shu)中(zhong)應(ying)用(yong)及(ji)床旁檢(jian)測(ce)(ce)(ce)。
本文將全面闡述質譜技術在醫(yi)學(xue)實驗室認可(ke)中的發展歷程，以及在醫學檢驗領域的主要應用情況和特點，同時剖析了質譜技術目前在臨床應用中主要痛點和未來可能的發展方向，希望能較為全面地綜述質譜技術臨床應用的現狀與未來。
一、質譜技(ji)術在醫學實驗室中的(de)發展(zhan)
從質譜技術最初進入(ru)醫學(xue)檢(jian)(jian)驗(yan)領(ling)(ling)域(yu)，至今發展(zhan)至多領(ling)(ling)域(yu)、寬范圍(wei)的(de)(de)應(ying)(ying)用(yong)，大(da)約經歷(li)了四十年的(de)(de)時間(jian)，最早始于(yu)20世(shi)紀80年代(dai)。由(you)于(yu)免疫法(fa)檢(jian)(jian)測存(cun)在(zai)假陽性(xing)，質譜技術開始從研(yan)究性(xing)實驗(yan)室走入(ru)臨床實驗(yan)室，如氣相色譜質譜 (gas chromatography mass spectrometry, GC-MS) 技術起初應(ying)(ying)用(yong)于(yu)軍事(shi)藥物(wu)監測。推(tui)動(dong)這種轉變(bian)出現的(de)(de)是發生在(zai)1981年的(de)(de)美國尼(ni)(ni)米(mi)茲號航空母艦(jian)事(shi)故。尼(ni)(ni)米(mi)茲號是美國海軍中最大(da)的(de)(de)一艘核動(dong)力航空母艦(jian)，1981年5月25日深(shen)夜，尼(ni)(ni)米(mi)茲號在(zai)準備回收模擬(ni)作戰歸來的(de)(de)機群時發生意(yi)外，引發大(da)火，該事(shi)故最終造(zao)成多人死傷(shang)。隨后采(cai)用(yong)免疫法(fa)檢(jian)(jian)測飛行(xing)員尿液樣本時發現，大(da)部分尿檢(jian)(jian)結果中大(da)麻代(dai)謝物(wu)呈陽性(xing)，表明(ming)軍隊(dui)中可能存(cun)在(zai)藥物(wu)濫用(yong)情況。
因免疫(yi)法檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)結果(guo)本身存在(zai)較高的假陽(yang)性率，所(suo)以需要(yao)(yao)使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)更為特異(yi)的GC-MS方法進(jin)行確認。而GC-MS在(zai)應用(yong)(yong)(yong)后的10年(nian)里(li)使(shi)(shi)大麻(ma)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)陽(yang)性率從18%降低至8%，這(zhe)也促使(shi)(shi)了(le)質(zhi)(zhi)譜技術(shu)進(jin)入毒理(li)實驗(yan)室并(bing)應用(yong)(yong)(yong)于濫用(yong)(yong)(yong)藥(yao)物檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)和治療藥(yao)物監測(ce)(ce)(ce)，臨床質(zhi)(zhi)譜檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)開始萌芽。1988年(nian)，美國聯邦(bang)藥(yao)品檢(jian)(jian)驗(yan)局發布強(qiang)制(zhi)性指南，要(yao)(yao)求(qiu)治療藥(yao)物監測(ce)(ce)(ce)必須使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)質(zhi)(zhi)譜法進(jin)行確認，奠定了(le)質(zhi)(zhi)譜技術(shu)在(zai)治療藥(yao)物監測(ce)(ce)(ce)中的重要(yao)(yao)地位[2]。
隨著GC-MS在(zai)醫學(xue)檢驗領域(yu)應用(yong)(yong)的(de)(de)逐(zhu)步增多，免(mian)疫(yi)法用(yong)(yong)于(yu)(yu)類固醇激(ji)素檢測的(de)(de)缺點也日益凸顯，尤(you)其是在(zai)測定婦女和(he)兒童(tong)體內(nei)低(di)濃度睪(gao)酮時(shi)。但因GC-MS主要適(shi)用(yong)(yong)于(yu)(yu)揮發(fa)(fa)性和(he)熱(re)穩定性化合物(wu)，樣(yang)品制(zhi)備程序(xu)復雜(za)，檢測通(tong)量低(di)，因此限(xian)制(zhi)了其在(zai)臨(lin)床(chuang)中的(de)(de)應用(yong)(yong)。20世紀80年代，快原子轟擊、電噴霧和(he)輔(fu)助激(ji)光解析等“軟電離”技術(shu)的(de)(de)發(fa)(fa)展(zhan)，使蛋白(bai)質、酶、核(he)酸等生物(wu)大(da)(da)分子的(de)(de)檢測成為可能，大(da)(da)大(da)(da)拓展(zhan)了質譜技術(shu)在(zai)醫學(xue)檢驗領域(yu)的(de)(de)應用(yong)(yong)范圍[1]。
20世(shi)紀90年代，串聯(lian)(lian)質譜(pu)(pu)技(ji)術開始應用(yong)于新生兒(er)篩查(cha)。而(er)電(dian)噴霧電(dian)離接(jie)口技(ji)術 (electrospray ionization interface technology, ESI) 發(fa)(fa)(fa)展(zhan)使得(de)兩(liang)(liang)種(zhong)強有(you)力的(de)(de)(de)(de)分析(xi)工具—液(ye)相系統和質譜(pu)(pu)系統的(de)(de)(de)(de)結合(he)成為(wei)了(le)(le)可能，兩(liang)(liang)者的(de)(de)(de)(de)結合(he)也進一步促進了(le)(le)液(ye)相色(se)譜(pu)(pu)-串聯(lian)(lian)質譜(pu)(pu) (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) 技(ji)術在醫學檢(jian)驗、臨床(chuang)研究及疾病診斷的(de)(de)(de)(de)應用(yong)發(fa)(fa)(fa)展(zhan)。液(ye)相色(se)譜(pu)(pu)質譜(pu)(pu)技(ji)術的(de)(de)(de)(de)聯(lian)(lian)用(yong)能夠使非(fei)揮(hui)發(fa)(fa)(fa)性和熱不穩定生物分子電(dian)離并在極低的(de)(de)(de)(de)濃度下得(de)到檢(jian)測，簡(jian)化了(le)(le)樣品制備流(liu)程，提高了(le)(le)檢(jian)測通量，極大縮短了(le)(le)報告周期，因而(er)在臨床(chuang)實驗室(shi)的(de)(de)(de)(de)常(chang)規檢(jian)測工作中(zhong)得(de)到了(le)(le)迅猛的(de)(de)(de)(de)發(fa)(fa)(fa)展(zhan)。
21世紀初期，質(zhi)譜技(ji)術(shu)開始嘗試(shi)應用(yong)于(yu)感染(ran)性(xing)疾病的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)，如(ru)血源性(xing)感染(ran)疾病的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子診斷。基質(zhi)輔助激(ji)光解(jie)吸(xi)電離(li)技(ji)術(shu) (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 的(de)(de)(de)(de)(de)發展則完美(mei)地(di)實現了生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)大(da)(da)分(fen)(fen)子的(de)(de)(de)(de)(de)軟離(li)子化，通過引入(ru)基質(zhi)分(fen)(fen)子，使待測(ce)分(fen)(fen)子不產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)碎(sui)片，解(jie)決了非揮發性(xing)和熱不穩定性(xing)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)大(da)(da)分(fen)(fen)子解(jie)吸(xi)離(li)子化的(de)(de)(de)(de)(de)問題(ti)，便(bian)捷地(di)將(jiang)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)樣(yang)本引入(ru)質(zhi)譜系統，并結合飛行時間質(zhi)量(liang)分(fen)(fen)析(xi)器 (time-of-flight, TOF) 技(ji)術(shu)，實現了微生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)快速鑒定分(fen)(fen)析(xi)，鑒定時間可縮短1.45d。相對于(yu)傳統的(de)(de)(de)(de)(de)微生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)檢(jian)測(ce)方法，MALDI-TOF可節省人力和時間，該應用(yong)也促進了質(zhi)譜技(ji)術(shu)在大(da)(da)分(fen)(fen)子檢(jian)測(ce)領域的(de)(de)(de)(de)(de)廣泛使用(yong)，將(jiang)質(zhi)譜的(de)(de)(de)(de)(de)應用(yong)推上了一個新的(de)(de)(de)(de)(de)臺階。
2013年(nian)，美國食品藥(yao)品監督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 首次認可使用(yong)MALDI-TOF對微生(sheng)物進行鑒定(ding)。另外，近幾年(nian)還出現了將質(zhi)譜技(ji)術用(yong)于實時指導癌癥(zheng)外科手(shou)術的前沿應用(yong)[2,5]。
在(zai)(zai)我(wo)國(guo)，質(zhi)譜(pu)技術在(zai)(zai)醫學檢(jian)驗(yan)中的(de)應用最(zui)早也始于治療藥(yao)物監測。隨后(hou)，質(zhi)譜(pu)技術在(zai)(zai)遺(yi)傳代謝病檢(jian)測、營養素檢(jian)測和微生物鑒定工作中作出的(de)突出貢獻(xian)，引起(qi)行業(ye)內的(de)廣泛(fan)關(guan)注。同時其在(zai)(zai)蛋白組(zu)學等研究領域也具有(you)良好的(de)前景，有(you)望成為醫學檢(jian)驗(yan)領域繼基因測序技術之(zhi)后(hou)的(de)下一個(ge)革命(ming)性技術。
二、質譜(pu)技術(shu)在醫學檢(jian)驗(yan)中的主要應用
1、質譜技(ji)術在臨床生化檢驗中的(de)應(ying)用(yong)
質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)在應用較(jiao)早的(de)國家已(yi)成(cheng)為(wei)(wei)繼(ji)免(mian)疫學方(fang)法(fa)和(he)化(hua)學發光法(fa)之(zhi)后的(de)第三大(da)生(sheng)化(hua)檢(jian)測(ce)技術(shu)。目前采用質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)檢(jian)測(ce)的(de)項目數量雖然與其他(ta)兩種方(fang)法(fa)相比(bi)還有很大(da)差(cha)距，但越來越多的(de)生(sheng)化(hua)檢(jian)測(ce)項目正被轉移至質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)平臺(tai)進(jin)行檢(jian)測(ce);質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)技術(shu)也成(cheng)為(wei)(wei)生(sheng)化(hua)檢(jian)驗領(ling)域新興(xing)的(de)發展方(fang)向(xiang)和(he)不可或缺(que)的(de)重要技術(shu)[6]。
質譜技術(shu)在(zai)臨床生化(hua)檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)中(zhong)應用最(zui)為成(cheng)熟的(de)(de)項目主要包括(kuo)：生化(hua)遺傳(chuan)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)、治療藥物監(jian)測(ce)(ce)(ce)、類固醇激(ji)素(su)(su)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)、營(ying)養素(su)(su)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)以及毒(du)理(li)學檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)。技術(shu)高特(te)異性的(de)(de)特(te)點(dian)可(ke)(ke)有(you)效(xiao)避免結構類似物對檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)結果(guo)的(de)(de)影(ying)響，為臨床提(ti)供更準(zhun)確的(de)(de)結果(guo)，提(ti)高患者的(de)(de)依從(cong)性。技術(shu)高靈敏度(du)的(de)(de)特(te)點(dian)可(ke)(ke)在(zai)很(hen)大程(cheng)度(du)上彌補內分(fen)泌(mi)類固醇激(ji)素(su)(su)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)中(zhong)，低濃度(du)化(hua)合物檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)困難(nan)(nan)和測(ce)(ce)(ce)不準(zhun)的(de)(de)難(nan)(nan)題，為疾病(bing)的(de)(de)預測(ce)(ce)(ce)和診療分(fen)型提(ti)供準(zhun)確結果(guo)。
國外許多(duo)內(nei)分泌(mi)實(shi)驗室已(yi)經將大部分體內(nei)激素類物(wu)(wu)(wu)質的(de)檢測(ce)(ce)(ce)由放射免(mian)疫學方法(fa)(fa)或(huo)免(mian)疫學方法(fa)(fa)轉(zhuan)換為(wei)LC-MS/MS方法(fa)(fa)，并將質譜技術作(zuo)為(wei)內(nei)分泌(mi)類固醇激素類物(wu)(wu)(wu)質檢測(ce)(ce)(ce)的(de)首選(xuan)方法(fa)(fa)。質譜技術一次(ci)可(ke)檢測(ce)(ce)(ce)多(duo)種(zhong)(zhong)化合物(wu)(wu)(wu)的(de)特點，可(ke)提(ti)高檢測(ce)(ce)(ce)通(tong)量、減(jian)少樣(yang)品用量和降低檢測(ce)(ce)(ce)成本(ben)。如在(zai)生化遺(yi)傳(chuan)檢測(ce)(ce)(ce)中(zhong)，質譜技術一次(ci)可(ke)分析60多(duo)種(zhong)(zhong)氨基酸和酰基肉堿，篩查40余種(zhong)(zhong)新生兒遺(yi)傳(chuan)代謝病;在(zai)營養素檢測(ce)(ce)(ce)中(zhong)一次(ci)可(ke)分析20種(zhong)(zhong)氨基酸、20種(zhong)(zhong)脂肪酸、10余種(zhong)(zhong)微量元素或(huo)5種(zhong)(zhong)脂溶性維(wei)生素，有效提(ti)高了(le)檢測(ce)(ce)(ce)通(tong)量、減(jian)少了(le)樣(yang)品用量，并提(ti)供(gong)了(le)豐富的(de)檢測(ce)(ce)(ce)信息;在(zai)毒(du)理學檢測(ce)(ce)(ce)中(zhong)一次(ci)可(ke)檢測(ce)(ce)(ce)尿液中(zhong)19種(zhong)(zhong)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)，實(shi)現了(le)高通(tong)量、快速高效的(de)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)篩查技術[7]。
在臨床生化檢驗領域，質譜技(ji)術(shu)相(xiang)比于傳統方法(fa)的(de)優勢較為突(tu)出，但隨著技(ji)術(shu)的(de)深入應(ying)用(yong)(yong)與經驗的(de)積累(lei)，技(ji)術(shu)應(ying)用(yong)(yong)的(de)缺(que)點也逐步凸顯出來，包括質譜技(ji)術(shu)應(ying)用(yong)(yong)的(de)陷(xian)阱(jing)問題、實驗室日常(chang)運行過程(cheng)中的(de)管理問題以及相(xiang)關政策(ce)法(fa)規問題等(deng)，主要體現在：
(1) 質(zhi)譜技術在分(fen)析(xi)基質(zhi)復雜(za)的(de)生物樣本時，檢(jian)測結(jie)果易受到基質(zhi)效(xiao)應(ying)、結(jie)構類(lei)似物干擾(rao)以(yi)及(ji)質(zhi)譜信號產生的(de)不(bu)穩定所帶來的(de)干擾(rao)影響;對這(zhe)些問題認識和預防(fang)不(bu)當，則(ze)質(zhi)譜的(de)檢(jian)測結(jie)果將存(cun)在較(jiao)大的(de)錯(cuo)誤風險;
(2) 質譜技術相(xiang)比(bi)于(yu)免疫學方法和化(hua)學發光法，檢(jian)測的自動(dong)化(hua)程度(du)較低，對(dui)人員依賴性較大(da);同時(shi)各廠家儀器系統(tong)(tong)還未實現(xian)與臨床(chuang)實驗(yan)室信(xin)息(xi)管理系統(tong)(tong) (LIS) 的接口雙向(xiang)對(dui)接，在數據處(chu)理和報告發放環(huan)節，仍未實現(xian)自動(dong)化(hua);
(3) 對(dui)于(yu)質譜技術應(ying)用(yong)較成(cheng)熟的項目，檢測數據仍(reng)缺(que)乏統一的應(ying)用(yong)標(biao)準[4];
(4) 質譜技術檢測方法所需的標準物質、試劑和耗材等，目前主要依(yi)賴于進口，較多的檢測項目受(shou)限于這(zhe)些因素而(er)開展受(shou)阻(zu);
(5) 目前質譜實驗室的方法基本為自建方法，標準化和規范化較為薄弱。美國臨床醫學實驗室(shi)認可標準化協會已發布了臨床質譜的使用指南[8]，中華醫學會檢驗醫學分會、衛生計生委臨床檢驗中心和《中華檢驗醫學雜志》編輯部也于2017年10月份共同發布了《液相色譜-質譜臨床應用建議》[9]，這些都為質譜技術臨床檢測工作提供良好了的指導和參考;
(6) 由于(yu)質譜技術較(jiao)為復雜，儀器(qi)(qi)構(gou)成多樣(yang)化，在實(shi)際的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)(yong)過程(cheng)中，需要有經(jing)驗的(de)(de)(de)專業技術人才進行規(gui)范的(de)(de)(de)使(shi)用(yong)(yong)操作，但目前國內(nei)相關的(de)(de)(de)技術人才匱乏;質譜實(shi)驗室的(de)(de)(de)儀器(qi)(qi)設(she)備昂貴，對于(yu)安裝條件有特殊要求，建設(she)需要投(tou)入大量的(de)(de)(de)資金;這些使(shi)得質譜技術臨(lin)床應(ying)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)門檻較(jiao)高，一定程(cheng)度上(shang)限制了(le)技術的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)(yong);
(7) 在日常運營過程中儀器的維修(xiu)(xiu)服務成本較高，維修(xiu)(xiu)周(zhou)期(qi)較長(chang)，維修(xiu)(xiu)的及時性也存在不能滿足(zu)臨床(chuang)檢測的報告(gao)周(zhou)期(qi)固定性的要求;
(8) 國(guo)內對于質譜(pu)技術(shu)在(zai)臨床的應用監管還不成熟，相(xiang)關的檢測項(xiang)目在(zai)臨床上無(wu)收費標準，也(ye)在(zai)一定程度上限(xian)制了技術(shu)的應用普及(ji)。
雖(sui)然(ran)質(zhi)(zhi)譜技術的(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)用仍存在較多缺陷，但隨(sui)(sui)著技術的(de)(de)(de)(de)(de)革新與(yu)發展，應(ying)用監管的(de)(de)(de)(de)(de)成熟，各項(xiang)瓶頸將被不(bu)斷(duan)突破，未來隨(sui)(sui)著質(zhi)(zhi)譜儀器(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)各項(xiang)性(xing)能的(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)升;前處理(li)自(zi)(zi)動(dong)化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)實現(xian)(xian);檢(jian)測(ce)數據自(zi)(zi)動(dong)輸出并實現(xian)(xian)與(yu)實驗(yan)室信息系(xi)統的(de)(de)(de)(de)(de)雙向對接，以及結果報告自(zi)(zi)動(dong)預警功能的(de)(de)(de)(de)(de)實現(xian)(xian)，質(zhi)(zhi)譜儀有望像免疫學方法和化(hua)學發光(guang)法一樣，成為臨床生化(hua)檢(jian)驗(yan)中自(zi)(zi)動(dong)化(hua)、智能化(hua)、易用化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)平臺(tai)。
2、質譜技術在微生物檢驗中的應用
近年來，MALDI-TOF技(ji)術(shu)(shu)(shu)已(yi)成功應用(yong)于微生(sheng)物(wu)的(de)鑒(jian)定及分型，并(bing)逐漸成為微生(sheng)物(wu)鑒(jian)定的(de)主流技(ji)術(shu)(shu)(shu)，可快速檢測(ce)和鑒(jian)定革蘭(lan)(lan)陽(yang)性(xing)菌(jun)(jun)(jun)、革蘭(lan)(lan)陰性(xing)菌(jun)(jun)(jun)、厭(yan)氧菌(jun)(jun)(jun)、分枝(zhi)桿菌(jun)(jun)(jun)、酵(jiao)母菌(jun)(jun)(jun)和絲(si)狀真菌(jun)(jun)(jun)等[6,10-14]。相比于傳統的(de)革蘭(lan)(lan)染色、菌(jun)(jun)(jun)落形(xing)態、表型鑒(jian)定及分子生(sheng)物(wu)學技(ji)術(shu)(shu)(shu)， MALDI-TOF技(ji)術(shu)(shu)(shu)具有快速、準確、經濟(ji)、高通量(liang)等優(you)點。MALDI-TOF是基(ji)于細菌(jun)(jun)(jun)表面蛋白分子檢測(ce)的(de)技(ji)術(shu)(shu)(shu)，通過測(ce)定未知微生(sheng)物(wu)自(zi)身獨(du)特的(de)蛋白質(zhi)指紋圖(tu)譜及特征性(xing)的(de)圖(tu)譜峰，并(bing)與數據庫中參考菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)的(de)蛋白指紋圖(tu)譜進行(xing)比對，從而實(shi)現(xian)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)的(de)鑒(jian)定[11]。
該(gai)技術是(shi)將完整的(de)(de)(de)(de)(de)微生物(wu)細(xi)胞(bao)直(zhi)接進行(xing)(xing)檢(jian)(jian)測，樣品(pin)制備簡單，檢(jian)(jian)測周轉(zhuan)時(shi)(shi)(shi)間(jian)短，在數(shu)分鐘內就可(ke)以(yi)得到一(yi)個菌種(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)測試結(jie)果(guo)，且(qie)(qie)分析(xi)(xi)用(yong)菌量(liang)極(ji)少，而(er)傳統方法完成常規細(xi)菌鑒(jian)定至少需要8~18h或(huo)更長時(shi)(shi)(shi)間(jian)。MALDI-TOF通過(guo)檢(jian)(jian)測細(xi)菌胞(bao)膜成分或(huo)表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)特異蛋白對(dui)細(xi)菌進行(xing)(xing)種(zhong)群的(de)(de)(de)(de)(de)鑒(jian)別，敏感性(xing)(xing)和(he)準(zhun)確性(xing)(xing)高，可(ke)以(yi)區分表(biao)型(xing)相似或(huo)相同的(de)(de)(de)(de)(de)菌株(zhu)，提供屬、種(zhong)、型(xing)水平的(de)(de)(de)(de)(de)鑒(jian)定，對(dui)臨床常見分離菌鑒(jian)定到種(zhong)水平的(de)(de)(de)(de)(de)準(zhun)確率很(hen)高。以(yi)16S r RNA基(ji)因測序結(jie)果(guo)為標(biao)準(zhun)，質譜(pu)檢(jian)(jian)測結(jie)果(guo)準(zhun)確率為90.0%~95.0%[15]，不僅可(ke)以(yi)識(shi)別病原(yuan)菌，而(er)且(qie)(qie)有助(zhu)于(yu)發現新的(de)(de)(de)(de)(de)病原(yuan)菌。此外，質譜(pu)技術還用(yong)于(yu)病原(yuan)體的(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)敏感性(xing)(xing)檢(jian)(jian)測，常規的(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)敏感性(xing)(xing)實驗(yan)方法比較費時(shi)(shi)(shi)，局限于(yu)少數(shu)細(xi)菌，MALDI-TOF通過(guo)比對(dui)耐藥(yao)菌株(zhu)和(he)藥(yao)物(wu)敏感菌株(zhu)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)特征性(xing)(xing)蛋白和(he)圖譜(pu)峰及檢(jian)(jian)測耐藥(yao)菌株(zhu)與抗生素(su)共培(pei)養(yang)后的(de)(de)(de)(de)(de)分解產物(wu)，可(ke)以(yi)分析(xi)(xi)幾乎所有的(de)(de)(de)(de)(de)耐藥(yao)機制。
研究表明，相(xiang)比(bi)于標準的(de)微(wei)生(sheng)物培養(yang)技術，質(zhi)譜(pu)技術可(ke)降低約50%的(de)試劑成(cheng)本(ben)和勞動力成(cheng)本(ben)[16]。但是，MALDI-TOF作為一項新興(xing)技術，在微(wei)生(sheng)物鑒(jian)(jian)定(ding)方面(mian)也(ye)存在著一定(ding)的(de)局限(xian)性。如對(dui)(dui)于具有特(te)殊結(jie)構的(de)菌(jun)種和圖(tu)譜(pu)極為相(xiang)似的(de)菌(jun)種的(de)鑒(jian)(jian)定(ding)區分(fen)存在一定(ding)的(de)難度、對(dui)(dui)于一些罕見菌(jun)種或新型(xing)細(xi)菌(jun)鑒(jian)(jian)定(ding)困難、對(dui)(dui)血培養(yang)樣本(ben)中的(de)混合菌(jun)種難以(yi)準確鑒(jian)(jian)別等，原因是質(zhi)譜(pu)數(shu)(shu)據(ju)庫(ku)中標準菌(jun)株的(de)圖(tu)譜(pu)有限(xian)、質(zhi)譜(pu)峰的(de)數(shu)(shu)據(ju)不充分(fen)以(yi)及細(xi)菌(jun)庫(ku)中無這些菌(jun)株[17,18]。
隨(sui)著儀(yi)器技術參數、質(zhi)譜數據庫(ku)及分(fen)析軟件的不斷更(geng)新完(wan)善，所有(you)的分(fen)離株將被(bei)逐步的明確鑒(jian)定出來(lai)。因此(ci)，隨(sui)著質(zhi)譜技術在(zai)臨床微生物(wu)實驗室的應用(yong)數據庫(ku)進一步完(wan)善，MALDI-TOF技術必將在(zai)微生物(wu)鑒(jian)定、菌種(zhong)分(fen)型、同源分(fen)析、耐藥監測等(deng)多方面發揮出更(geng)大作用(yong)，有(you)望成(cheng)為新一代(dai)病原微生物(wu)診斷的常規技術。
3、質(zhi)譜技術在核酸檢測中的應用
核(he)(he)酸(suan)質(zhi)譜(pu)檢(jian)測(ce)(ce)技術是(shi)(shi)在(zai)MALDI-TOF原理的(de)基(ji)礎上，結(jie)合(he)引(yin)物延伸分析(xi)法和堿基(ji)特(te)異裂解(jie)分析(xi)法，針對雙鏈DNA的(de)特(te)性進行了特(te)殊優(you)化(hua)，使樣品在(zai)電離過程中不產生或產生較少的(de)碎片離子，可用于(yu)(yu)檢(jian)測(ce)(ce)核(he)(he)酸(suan)的(de)分子量和研究基(ji)因組單(dan)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)多態(tai)性 (single nucleotide polymorphism, SNP) ，是(shi)(shi)近年來應用于(yu)(yu)臨床核(he)(he)酸(suan)檢(jian)測(ce)(ce)的(de)新(xin)型軟電離生物質(zhi)譜(pu)[19]。相比于(yu)(yu)以凝膠電泳為基(ji)礎的(de)測(ce)(ce)序法，質(zhi)譜(pu)技術具有分辨率(lv)高(gao)、分離速度(du)快、雜質(zhi)干擾少的(de)優(you)點，被廣泛應用于(yu)(yu)核(he)(he)酸(suan)測(ce)(ce)序、核(he)(he)酸(suan)指(zhi)紋圖譜(pu)、核(he)(he)酸(suan)SNP分析(xi)等(deng)[20]。
SNP是指(zhi)(zhi)基(ji)(ji)(ji)(ji)因組DNA序(xu)列上(shang)某個(ge)(ge)位置單個(ge)(ge)核苷酸堿基(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)差(cha)(cha)異(yi)，即基(ji)(ji)(ji)(ji)因位點(dian)的(de)(de)(de)突變，在(zai)人群中(zhong)的(de)(de)(de)發生頻(pin)率大于1%，是決(jue)定個(ge)(ge)體疾病(bing)易感性和(he)藥(yao)(yao)物反應性差(cha)(cha)異(yi)的(de)(de)(de)重要因素，通過分(fen)(fen)析突變的(de)(de)(de)位點(dian)，可預(yu)測(ce)疾病(bing)，并提供診斷(duan)意見和(he)指(zhi)(zhi)導用(yong)藥(yao)(yao)。MALDI-TOF分(fen)(fen)析檢測(ce)SNP是根(gen)據不同的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子量將等位基(ji)(ji)(ji)(ji)因排(pai)序(xu)，區(qu)分(fen)(fen)和(he)鑒(jian)別相對分(fen)(fen)子量達7000左右 (含20多個(ge)(ge)堿基(ji)(ji)(ji)(ji)) 、僅存在(zai)1個(ge)(ge)堿基(ji)(ji)(ji)(ji)差(cha)(cha)別的(de)(de)(de)不同DNA，可以(yi)精準地(di)分(fen)(fen)辨到堿基(ji)(ji)(ji)(ji)種(zhong)類(lei)。
藥(yao)物(wu)(wu)代(dai)謝(xie)酶(mei)(mei)遺傳多態性(xing)是產生藥(yao)物(wu)(wu)毒副作用(yong)(yong)、降低(di)或喪失藥(yao)物(wu)(wu)療效的主要(yao)原(yuan)因之一(yi)，通過檢測(ce)藥(yao)物(wu)(wu)代(dai)謝(xie)酶(mei)(mei)的基(ji)因型可對(dui)(dui)(dui)臨(lin)床用(yong)(yong)藥(yao)方案進(jin)(jin)行(xing)(xing)指導和(he)調(diao)整，為臨(lin)床個體化(hua)用(yong)(yong)藥(yao)提(ti)供依據。以往檢測(ce)藥(yao)物(wu)(wu)代(dai)謝(xie)酶(mei)(mei)基(ji)因多態性(xing)通常(chang)采用(yong)(yong)化(hua)學法(fa)(fa)，依賴于核苷(gan)酸(suan)的互(hu)補性(xing)對(dui)(dui)(dui)核酸(suan)序(xu)列進(jin)(jin)行(xing)(xing)分析，對(dui)(dui)(dui)于序(xu)列的長度(du)、復(fu)雜性(xing)、反應條件等都具有較高的要(yao)求，容易(yi)受到不同程度(du)的化(hua)學因素干(gan)擾，導致檢測(ce)結果(guo)出現偏差。若能將化(hua)學和(he)物(wu)(wu)理方法(fa)(fa)結合起來對(dui)(dui)(dui)藥(yao)物(wu)(wu)代(dai)謝(xie)酶(mei)(mei)基(ji)因進(jin)(jin)行(xing)(xing)檢測(ce)，將極大(da)提(ti)高檢測(ce)結果(guo)的準(zhun)確性(xing)。
MALDI-TOF是藥(yao)(yao)物代謝酶基(ji)因(yin)多態性的(de)新(xin)型檢測(ce)(ce)方法，其根據(ju)核苷酸分(fen)(fen)子(zi)被(bei)電離后在真空管中的(de)飛行時間來確定其分(fen)(fen)子(zi)量大小，最終確定核苷酸序(xu)(xu)列，檢測(ce)(ce)結果僅僅依(yi)賴于(yu)核酸分(fen)(fen)子(zi)量。經過驗(yan)(yan)證比較，MALDI-TOF檢測(ce)(ce)結果與Sanger測(ce)(ce)序(xu)(xu)的(de)結果符合率為100%[21,22]。傳統的(de)Sanger測(ce)(ce)序(xu)(xu)方法雖然是序(xu)(xu)列測(ce)(ce)定的(de)金標(biao)準，但其操作(zuo)步驟繁瑣費時和試劑(ji)成本高等限制了其臨(lin)床(chuang)應用。MALDI-TOF可通(tong)(tong)過一次實(shi)驗(yan)(yan)檢測(ce)(ce)多個(ge)標(biao)本的(de)多個(ge)突變，實(shi)現(xian)基(ji)因(yin)型的(de)高通(tong)(tong)量、快速檢測(ce)(ce)，為個(ge)體化用藥(yao)(yao)提供更加多樣化的(de)檢測(ce)(ce)手(shou)段(duan)。
4、質譜技術在蛋白質組學中的(de)應用
質譜(pu)技術可檢(jian)測蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)氨基酸組(zu)成、分子量、多(duo)(duo)肽或(huo)二硫鍵的(de)數目(mu)與位置(zhi)及蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)空間(jian)構(gou)象等，從而實現未知肽段的(de)篩選、測序、肽指紋(wen)圖譜(pu)、蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質表達譜(pu)、蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質翻譯后(hou)修飾譜(pu)、全蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)完整無損分析等。質譜(pu)多(duo)(duo)樣(yang)化的(de)前端連接方式極大地促進(jin)了研(yan)究者對基礎蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)科(ke)學領域的(de)認識，但將(jiang)這(zhe)些(xie)認識轉變為(wei)對臨床實踐(jian)的(de)有效(xiao)信(xin)息(xi)則有相當大的(de)難度。到目(mu)前為(wei)止，基于質譜(pu)技術的(de)將(jiang)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)組(zu)學多(duo)(duo)樣(yang)性的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)和(he)多(duo)(duo)肽標志物， 成功應用(yong)于臨床檢(jian)測的(de)案(an)例(li)并不多(duo)(duo)見[22]。
相(xiang)反，對(dui)于已(yi)知(zhi)的(de)(de)(de)、確定的(de)(de)(de)多(duo)肽和(he)蛋(dan)(dan)白(bai)標(biao)志物(wu)(wu)即目標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)組學，質(zhi)譜(pu)(pu)技(ji)術(shu)(shu)得(de)到(dao)了較好的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)。目前(qian)，已(yi)經(jing)有(you)一(yi)些(xie)關于LC-MS/MS用(yong)于臨床(chuang)目標(biao)多(duo)肽和(he)蛋(dan)(dan)白(bai)分(fen)析(xi)的(de)(de)(de)文章發表，如甲狀腺球蛋(dan)(dan)白(bai) (Tg) 和(he)淀粉樣蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)鑒定與定量分(fen)析(xi)等[23-25]。質(zhi)譜(pu)(pu)技(ji)術(shu)(shu)在(zai)(zai)這一(yi)領域的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)，在(zai)(zai)很多(duo)情(qing)況下均可(ke)(ke)為臨床(chuang)提供有(you)價值的(de)(de)(de)信(xin)息(xi)[21]，如對(dui)某一(yi)分(fen)析(xi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)免疫學方(fang)(fang)法(fa)(fa)不(bu)存(cun)在(zai)(zai)時;已(yi)經(jing)存(cun)在(zai)(zai)的(de)(de)(de)免疫學方(fang)(fang)法(fa)(fa)不(bu)能(neng)給(gei)出某些(xie)臨床(chuang)關鍵問題的(de)(de)(de)答案(an)時;已(yi)經(jing)存(cun)在(zai)(zai)的(de)(de)(de)免疫學方(fang)(fang)法(fa)(fa)存(cun)在(zai)(zai)干擾時;某一(yi)分(fen)析(xi)物(wu)(wu)存(cun)在(zai)(zai)多(duo)個異構體時;對(dui)同一(yi)分(fen)析(xi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)檢測(ce)，不(bu)同的(de)(de)(de)檢測(ce)方(fang)(fang)法(fa)(fa)間存(cun)在(zai)(zai)較大的(de)(de)(de)結果變異性時;已(yi)經(jing)存(cun)在(zai)(zai)的(de)(de)(de)分(fen)析(xi)方(fang)(fang)法(fa)(fa)流程較為復雜時，質(zhi)譜(pu)(pu)技(ji)術(shu)(shu)均可(ke)(ke)發揮相(xiang)應(ying)作用(yong)，彌補免疫學方(fang)(fang)法(fa)(fa)的(de)(de)(de)不(bu)足。
質譜技術(shu)在醫學檢(jian)驗(yan)領(ling)域中應用(yong)的(de)(de)(de)下個目標(biao)和挑戰，是如何(he)彌補免疫學方(fang)法在蛋白和多(duo)肽檢(jian)測(ce)(ce)方(fang)面的(de)(de)(de)局(ju)限性。相(xiang)信隨(sui)著技術(shu)的(de)(de)(de)發(fa)展，這方(fang)面的(de)(de)(de)突破會越來(lai)越多(duo)，為臨床提供更多(duo)的(de)(de)(de)有價(jia)值的(de)(de)(de)質譜檢(jian)測(ce)(ce)數據。
