PCR實驗室的污染來源

　　1、樣本間交叉污染：

　　收集(ji)樣本(ben)(ben)(ben)的(de)容器被(bei)污染(ran)或樣本(ben)(ben)(ben)密封不(bu)嚴外溢;不(bu)同樣本(ben)(ben)(ben)移(yi)液(ye)時忘記更(geng)換槍(qiang)尖或未使(shi)用帶濾(lv)芯槍(qiang)尖;移(yi)液(ye)器等實(shi)驗(yan)器具及耗(hao)材未及時消(xiao)毒滅菌;不(bu)同樣本(ben)(ben)(ben)同時開蓋或樣本(ben)(ben)(ben)劇烈震(zhen)蕩(dang)、反復(fu)吹吸導致氣(qi)溶膠形成擴散，相互交(jiao)叉污染(ran)。

　　2、實(shi)驗試劑污染：

　　主要是在 PCR 組(zu)分試(shi)(shi)劑加(jia)樣過程(cheng)中，由于移液器(qi)、容器(qi)、陰(yin)性(xing)對(dui)照及其(qi)它試(shi)(shi)劑被核酸模板(ban)或陽性(xing)對(dui)照污染。 加(jia)樣過程(cheng)中，因為 PCR 試(shi)(shi)劑對(dui)溫度十(shi)分敏(min)感，需(xu)要通(tong)過冰浴(yu)使得 PCR 試(shi)(shi)劑和 PCR 板(ban)/管處于 0℃，但這個(ge)過程(cheng)也是充滿了污染的風險的。

　　3、擴增產物污染：

　　大量(liang)拷(kao)貝(bei)的(de)產(chan)物泄漏或擴增后的(de)PCR反應(ying)管意外開(kai)蓋，這是 PCR 反應(ying)中最主要最常見的(de)污染(ran)(ran)問題。因為 PCR 產(chan)物拷(kao)貝(bei)量(liang)大，遠(yuan)遠(yuan)高于 PCR 檢測數個(ge)拷(kao)貝(bei)的(de)極限，所以(yi)極微量(liang)的(de) PCR 產(chan)物污染(ran)(ran)，就(jiu)可(ke)形(xing)成(cheng)假陽性。

　　4、克隆質粒污(wu)染：

　　作為(wei)陽性質控品(pin)的克隆質粒外溢。

　　PCR實驗室的防污染方法

　　按(an)照實(shi)(shi)驗室(shi)的安全工(gong)作(zuo)制度(du)或安全標準操(cao)作(zuo)程(cheng)序，所有操(cao)作(zuo)符合《實(shi)(shi)驗室(shi)生(sheng)物安全通用要求》(GB19489-2008)。

　　1、嚴格執行各區功(gong)能劃(hua)分(fen)：

　　試(shi)劑儲存(cun)和(he)準(zhun)備區(qu)：貯存(cun)試(shi)劑的(de)(de)制備、試(shi)劑的(de)(de)分裝和(he)擴增(zeng)反應(ying)混合液的(de)(de)準(zhun)備，以(yi)及離心管(guan)、吸頭(tou)等消耗品(pin)的(de)(de)貯存(cun)和(he)準(zhun)備。

　　標本制備區：核酸(RNA、DNA)提取(qu)、貯存及(ji)其加入至擴(kuo)增反應(ying)管。對于涉及(ji)臨床樣本的(de)操(cao)作，應(ying)符合生(sheng)物安全二級實驗(yan)室防(fang)護設(she)備、個人防(fang)護和操(cao)作規范(fan)的(de)要求。

　　擴增(zeng)(zeng)區：cDNA合成(cheng)、DNA擴增(zeng)(zeng)及檢測(ce)。

　　擴增(zeng)產(chan)物分析區：擴增(zeng)片段的進一步分析測定，如雜交(jiao)、酶切電泳、變性高(gao)效液(ye)相分析、測序等。

　　試(shi)劑(ji)準(zhun)備區、樣本制備區和擴(kuo)增(zeng)區內的實驗用(yong)品，包括移液器等(deng)器具應(ying)專用(yong)，空氣(qi)、物(wu)(wu)品流向依(yi)次(ci)為：試(shi)劑(ji)準(zhun)備區、樣本制備區、擴(kuo)增(zeng)區、產(chan)物(wu)(wu)分析區，不可逆(ni)行。

　　2、清潔的實驗用品：

　　實驗室自配試劑(去(qu)離子水、緩沖液等)和所有使用器具在(zai)使用之(zhi)前均應高(gao)壓滅菌(jun)或(huo)紫外殺菌(jun)。槍尖(jian)、反應管等實驗耗材應一次性使用。

　　3、正(zheng)確(que)的(de)實(shi)驗(yan)操(cao)作：

　　實驗應在(zai)超凈(jing)工作臺內進(jin)行(xing)，工作臺內應放置PCR專用的(de)(de)微量離心(xin)機、各量程(cheng)的(de)(de)移液器和其他必需物(wu)品。

　　實(shi)驗(yan)(yan)的(de)過(guo)程(cheng)中選擇最合適(shi)尺(chi)寸的(de)手套并能及時更換，在進出不同實(shi)驗(yan)(yan)區域或(huo)進行(xing)模(mo)板操作后都應更換實(shi)驗(yan)(yan)服、口罩、帽子(zi)及手套，以避免不同實(shi)驗(yan)(yan)區交叉(cha)污染。

　　裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬(shun)時離心，將管壁(bi)及管蓋上(shang)的液(ye)體離至管底，降低(di)污染(ran)手套(tao)或加樣(yang)器的風險;謹慎開啟反應管，防止管內(nei)液(ye)體濺出(chu)或形成(cheng)氣溶膠(jiao)導致(zhi)污染(ran)。

　　吸加試(shi)劑和(he)模板(ban)的操作應嚴格按照規范要(yao)求進行，遵守“慢吸快打”原則，盡量(liang)一次(ci)性(xing)完成(cheng)，忌多(duo)次(ci)抽吸，以避免氣溶膠產生的交叉污染。

　　PCR試劑建(jian)議小量分(fen)裝，以減(jian)少反復(fu)凍融、重復(fu)取樣(yang)次數;多樣(yang)本PCR反應時，先配制反應混合液分(fen)裝至反應管中，最后加入(ru)樣(yang)本核酸，請勿同時開(kai)蓋(gai)，盡量保證單(dan)人單(dan)管，實現完全閉(bi)管操作。

　　實(shi)驗(yan)試劑應與樣(yang)品和PCR產物(wu)分開(kai)保存，不應放于(yu)同處(chu)。

　　PCR擴增實驗完成后及時將(jiang)反應管(guan)取出，用(yong)一次性手套(tao)將(jiang)產物反應管(guan)包裹丟(diu)棄，保(bao)證管(guan)蓋緊閉。

　　4、規范的實驗設(she)計：

　　應(ying)遵循實(shi)驗(yan)(yan)室內部質量控(kong)制的(de)相(xiang)關(guan)規(gui)定，實(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)設立陽性(xing)(xing)對照、陰性(xing)(xing)對照和(he)空白對照，全程質控(kong)實(shi)驗(yan)(yan)過程，驗(yan)(yan)證PCR反應(ying)的(de)可靠(kao)性(xing)(xing)，并協助(zhu)判斷擴增系統(tong)的(de)可信性(xing)(xing)。

　　PCR實驗室的污染應急處理方法

　　1、若(ruo)核酸樣(yang)本(ben)溢(yi)出：

　　立即(ji)用布或紙巾(jin)覆蓋，由(you)外圍向中心傾倒10%的(de)次(ci)(ci)氯(lv)酸消(xiao)毒劑，約30分(fen)鐘(zhong)后，清除污染物品，再用次(ci)(ci)氯(lv)酸消(xiao)毒劑擦拭(shi)，并用75%酒精噴(pen)灑(sa)，移(yi)動紫(zi)外車定點照射1小時(shi)。

　　2、其(qi)他(ta)不(bu)明(ming)情(qing)況(kuang)污染：

　　(1)暫停所有實(shi)驗(yan)操作;

　　(2)清理實(shi)驗室(shi)內所有(you)物品，尋找污(wu)染來源;

　　(3)加大實驗(yan)室的(de)通風;

　　(4)對實驗室內所有表面(mian)(mian)(臺(tai)面(mian)(mian)、地面(mian)(mian)及墻面(mian)(mian)) 進行(xing)消(xiao)毒;

　　(5)75%酒(jiu)精空中噴霧(wu);

　　(6)開啟(qi)紫外消(xiao)毒裝(zhuang)置，延長紫外照射時間(jian)(4小時以(yi)上);

　　(7)以上措施每日進行，直至污(wu)(wu)染(ran)(ran)消除;用(yong)新試(shi)(shi)劑(ji)及確認無污(wu)(wu)染(ran)(ran)的(de)器(qi)材進行原污(wu)(wu)染(ran)(ran)項目的(de)試(shi)(shi)劑(ji)空白檢測，連續3次均陰性后(hou)方可進行常規檢測。