高效液相色譜(pu)技術(shu)最早應用于藥(yao)(yao)(yao)物(wu)領域，包括效能/純(chun)度(du)/性(xing)能分(fen)析(xi)、藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(代謝(xie))動力學/生物(wu)分(fen)析(xi)測(ce)試、純(chun)化、高通量(liang)(liang)篩選(HTS)、過程控制(zhi)(IPC)監測(ce)和質量(liang)(liang)控制(zhi)(QC)測(ce)試。制(zhi)藥(yao)(yao)(yao)行業是(shi)HPLC的主要應用市場，同時也是(shi)HPLC向更(geng)高通量(liang)(liang)和更(geng)優性(xing)能發展(zhan)(zhan)的主要驅動力。本文簡要回(hui)顧了過去十(shi)年影響藥(yao)(yao)(yao)物(wu)分(fen)析(xi)發展(zhan)(zhan)的HPLC的重大進展(zhan)(zhan)。討論的主題如下，部(bu)分(fen)項(xiang)目體現在一個典型的時間軸(zhou)上，如圖1所示(shi)。
圖1 過(guo)去十(shi)年中(zhong)影響藥物(wu)分析發展的HPLC技術進展(部分項目(mu))
本(ben)文的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是為(wei)繁忙的(de)(de)(de)(de)(de)(de)制藥科學家提供(gong)一個簡潔又全(quan)面的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HPLC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)技術進展,每個主題都有實際使用(yong)(yong)(yong)過程中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)便利和應用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)簡短描(miao)述(shu)，從用(yong)(yong)(yong)戶的(de)(de)(de)(de)(de)(de)角度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)評論，以及主要(yao)參考(kao)文獻(略)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)支撐(cheng)。
超高壓液相色譜(UHPLC)
UHPLC的(de)革(ge)命性創新(xin)始于1997年(nian)James Jorgenson教授在(zai)(zai)概念(nian)驗(yan)證方面(mian)的(de)研究，緊接著第一個商業化(hua)系統于2004年(nian)推出。今天，從HPLC到(dao)UHPLC的(de)轉化(hua)大部分(fen)都(dou)是由主要(yao)制造商完成，這些(xie)制造商目(mu)前都(dou)可以供應(ying)(ying)某種類型的(de)UHPLC產品。UHPLC系統、柱子(zi)以及應(ying)(ying)用的(de)詳(xiang)細綜述在(zai)(zai)其(qi)他(ta)地方都(dou)可以看(kan)到(dao)。UHPLC在(zai)(zai)藥(yao)物分(fen)析領域(yu)的(de)基本原理、優勢、潛(qian)在(zai)(zai)的(de)問題和最佳應(ying)(ying)用都(dou)有充分(fen)的(de)文件記錄(lu)。
表1概述(shu)了UHPLC的(de)(de)(de)突出特點和優勢。注意，較(jiao)高(gao)的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)壓力(li)允許(xu)使(shi)用更(geng)小(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)微粒(li)填(tian)充的(de)(de)(de)柱子(zi)(如(ru)亞(ya)2μm)得到更(geng)快(kuai)的(de)(de)(de)分析速度(圖2)或(huo)(huo)復雜樣(yang)(yang)品更(geng)出色的(de)(de)(de)分離(圖3)。由于使(shi)用改良的(de)(de)(de)進樣(yang)(yang)器(qi)，內徑(jing)較(jiao)小(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)管(guan)路系(xi)統(tong)(< 0.005英寸)，更(geng)小(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)紫外檢測(ce)器(qi)流(liu)動池(0.5 - 2μL)，所有的(de)(de)(de)UHPLC都有比較(jiao)低(di)的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)擴(kuo)散(4σ時，~10-20μL)。比較(jiao)典型的(de)(de)(de)應用是內徑(jing)為(wei)2.1–3.0mm的(de)(de)(de)柱子(zi)，填(tian)充物為(wei)亞(ya)2μm或(huo)(huo)亞(ya)3μm顆粒(li)。其他重(zhong)要的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)特征包括更(geng)小(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)系(xi)統(tong)死(si)體(ti)積(0.1-0.3 mL)和更(geng)快(kuai)的(de)(de)(de)檢測(ce)器(qi)響應/數據采集速率(lv)(>40 pt/s)，以實(shi)現高(gao)通量的(de)(de)(de)應用。
表1 UHPLC的突出特點和(he)優勢
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UHPLC的系統特點 |
范圍和評論 |
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最(zui)高壓力(li)限制 |
15000到(dao)19000psi(1000到(dao)1250bar),流速2-5mL/min.兼容傳統的和(he)亞-2微米(mi)顆粒(li)的色(se)譜柱。 |
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低系統色散 |
根(gen)據儀器配置，儀器帶寬5-20μL（4σ），使用較(jiao)小的連接(jie)管（<0.005"I.D）和(he)小UV流通池（0.5-2μL）,減小系統(tong)頻帶展(zhan)寬。兼容ID低(di)至2-3mm的色譜柱。 |
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低的梯度保留體積 |
100-400μL（對于(yu)四元液相泵會(hui)更高），兼容高通(tong)量篩選（HTS）。小(xiao)的(de)保留（混合(he)）體積(ji)可能影響(xiang)UV檢測器噪聲(sheng)。 |
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其他 |
HTS快(kuai)速的(de)注(zhu)射(she)周期（-20s）和(he)檢測(ce)響(xiang)應，以及高的(de)采集(ji)率（>40pt/t），兼容目前(qian)的(de)HPLC方法需(xu)求（如流量范(fan)圍、柱溫箱尺寸、進樣(yang)環路） |
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UHPLC的優勢 |
評論 |
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高通量 |
在保(bao)持(chi)相似分辨率的情況下(xia)，與傳統的HPLC方法相比(bi)通量(liang)提高3-10倍。如純(chun)度(du)分析5min（UHPLC）/20min（HPLC）。 |
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快速方法開(kai)發 |
短色譜柱(zhu)(zhu)，快速(su)(su)分析(xi)是色譜柱(zhu)(zhu)和流動相快速(su)(su)篩選(xuan)及(ji)方法優化(hua)的理想(xiang)選(xuan)擇(ze)。 |
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高(gao)分辨(bian) |
相對(dui)于HPLC，分(fen)辨率提高(gao)3倍(bei)，比如峰容量（Pc）400-600(HPLC為200) |
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溶劑節省 |
分析(xi)時間短，使用較小ID的色譜(pu)柱，相比HPLC溶劑(ji)節(jie)省(sheng)5-15倍。 |
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高靈敏度 |
質量靈敏(min)度增加3-10倍（樣品(pin)注入量減少）。長路徑UV流通(tong)池（50-60min）可以將濃度靈敏(min)度提高6倍。 |
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高(gao)精度 |
保(bao)留(liu)時間（2-3倍(bei)）和峰面積(ji)精密度（<1%RSD，進樣體積(ji)>1μL ）顯著增加(jia) |
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可以與其他的方法聯用 |
UHPLC兼(jian)容高溫LC，2D-LC或者核殼色譜(pu)柱(zhu)（單一或者組合聯(lian)用）。這些(xie)都是(shi)可選(xuan)項，而不(bu)是(shi)“有它就不(bu)能有它”。 |
與傳統的(de)(de)HPLC相比(bi)(bi)，UHPLC具有分(fen)(fen)析(xi)速度快的(de)(de)優勢，圖(tu)2闡述了一種藥物分(fen)(fen)析(xi)由HPLC方法轉移為UHPLC方法的(de)(de)譜圖(tu)對比(bi)(bi)。從HPLC到UHPLC，根據幾何(he)尺寸按比(bi)(bi)例縮放色譜柱及操作(zuo)參(can)數,可以在相同分(fen)(fen)辨率(lv)的(de)(de)情況下(xia)將分(fen)(fen)析(xi)時間減少10倍，這并不(bu)罕見。“保證好(hao)的(de)(de)分(fen)(fen)辨率(lv)的(de)(de)情況下(xia)進行更(geng)快的(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)”這是大多(duo)數用(yong)戶考慮(lv)購買更(geng)昂(ang)貴(gui)的(de)(de)UHPLC設備的(de)(de)主要(yao)誘因。
UHPLC的(de)(de)另一個(ge)重(zhong)要的(de)(de)好處是其(qi)(qi)對復雜樣品優秀的(de)(de)分離(li)(li)能(neng)力。這方面常常被忽視,在(zai)文獻中(zhong)也很少(shao)報道。在(zai)合理的(de)(de)時間跨度(~1 h)內(nei)，400至1000范(fan)圍內(nei)的(de)(de)峰(feng)(feng)容量(PC)已經通(tong)(tong)過(guo)使用(yong)(yong)UHPLC來(lai)證實。峰(feng)(feng)容量是分辨(bian)率為(wei)1.0時，色(se)譜圖(tu)(tu)上(shang)可(ke)以(yi)(yi)分辨(bian)的(de)(de)色(se)譜峰(feng)(feng)個(ge)數；通(tong)(tong)常傳(chuan)統(tong)的(de)(de)HPLC為(wei)200左(zuo)右。有史以(yi)(yi)來(lai)第一次,UHPLC可(ke)以(yi)(yi)在(zai)單一維度,對復雜的(de)(de)藥品、天然材料、和(he)其(qi)(qi)他困難樣品基質(zhi)提(ti)供更有效的(de)(de)分析。圖(tu)(tu)3a和(he)3b通(tong)(tong)過(guo)兩個(ge)應用(yong)(yong) (植物提(ti)取物和(he)胰蛋白酶的(de)(de)消化蛋白質(zhi))來(lai)說明Pc>300時，當前UHPLC的(de)(de)高分辨(bian)分離(li)(li)能(neng)力。
UHPLC的(de)(de)其他優勢包括溶劑節(jie)省(5-15倍),增(zeng)(zeng)強的(de)(de)質(zhi)量(liang)靈敏(min)(min)(min)度(du)(du)(3-10倍)，以(yi)及在(zai)保留時(shi)間(2–3倍)和峰面積(ji)(<0.1%RSD)方面的(de)(de)卓越性(xing)能。注(zhu)意(yi)，有(you)(you)關UHPLC中UV檢測靈敏(min)(min)(min)度(du)(du)增(zeng)(zeng)加的(de)(de)報(bao)告往往會產生誤導(dao)(dao),因(yin)為質(zhi)量(liang)敏(min)(min)(min)感度(du)(du)(分析(xi)物(wu)注(zhu)入量(liang))主要與柱的(de)(de)空(kong)隙體積(ji)有(you)(you)關。通(tong)(tong)常，UHPLC不(bu)會增(zeng)(zeng)加濃(nong)度(du)(du)靈敏(min)(min)(min)度(du)(du)(最(zui)理想的(de)(de)一種靈敏(min)(min)(min)度(du)(du)),因(yin)為我們不(bu)能希望使用小的(de)(de)流(liu)通(tong)(tong)池來增(zeng)(zeng)加信噪比，除非延長流(liu)通(tong)(tong)池的(de)(de)路徑長度(du)(du) (如(ru)(ru)60毫(hao)米)。泵(beng)混(hun)合而導(dao)(dao)致(zhi)的(de)(de)粘性(xing)發熱(re)、基線(xian)擾(rao)動(dong)以(yi)及方法(fa)轉(zhuan)移(yi)等潛在(zai)問(wen)題(ti)已(yi)經(jing)有(you)(you)文獻(xian)描述，而且這(zhe)些(xie)問(wen)題(ti)分別也是與特定的(de)(de)儀器(qi)相關聯的(de)(de)。一般來說,這(zhe)些(xie)技術問(wen)題(ti)已(yi)經(jing)研究(jiu)得比較(jiao)清楚了，而且通(tong)(tong)過選擇合適的(de)(de)系(xi)統配置(如(ru)(ru)混(hun)合器(qi)體積(ji))能夠很(hen)容易(yi)地減輕。但是, 由于培訓(xun)、與驗(yan)證數據系(xi)統的(de)(de)兼容性(xing)和其他方法(fa)轉(zhuan)移(yi)的(de)(de)問(wen)題(ti)，UHPLC在(zai)QC實驗(yan)室的(de)(de)應(ying)用仍然(ran)比較(jiao)浪費時(shi)間。
圖2 以商業制藥(yao)配方(Rapidocain) 質量控制分析為例：從傳統的HPLC到UHPLC使用幾何比例縮放。峰識(shi)別:1:對羥基苯甲(jia)酸(suan)甲(jia)酯(zhi),2:2、6-二甲(jia)基苯胺,3:尼(ni)泊金(jin)丙酯(zhi),4:利多(duo)卡因。HPLC條(tiao)件(jian):色譜(pu)柱RP18 150 x4.6毫米(mi),5μm, F=1ml/min, Vinj=20μL。UHPLC條(tiao)件(jian): 色譜(pu)柱RP18 x2.1 50毫米(mi),1.7μm,F = 600μL /min,Vinj = 1.4μL。超快UHPLC條(tiao)件(jian):色譜(pu)柱RP18 x2.1 50毫米(mi),1.7μm,F = 1000μL /min,Vinj =1.4μL[16]。
我(wo)們經常聽到一些爭論，UHPLC也許并(bing)不(bu)需要,因(yin)為(wei)其他方(fang)(fang)法(fa)(fa)(高(gao)溫LC、核殼柱子或(huo)二維LC)可(ke)(ke)以更(geng)合算的(de)(de)提高(gao)速(su)度(du)或(huo)分辨(bian)率。這種(zhong)推理并(bing)不(bu)是(shi)(shi)真實(shi)有(you)(you)根據的(de)(de)，因(yin)為(wei)與傳(chuan)統的(de)(de)HPLC相比(bi)，UHPLC在使用(yong)過(guo)程會中(zhong)可(ke)(ke)以與一個或(huo)多個以上的(de)(de)這些方(fang)(fang)法(fa)(fa)聯(lian)用(yong)獲得更(geng)出色的(de)(de)結果。這些方(fang)(fang)法(fa)(fa)都是(shi)(shi)可(ke)(ke)選項,而不(bu)是(shi)(shi)“有(you)(you)它就不(bu)能有(you)(you)它”。此外,“UHPLC”這個詞語可(ke)(ke)能在幾年內最(zui)終消(xiao)失，因(yin)為(wei)所有(you)(you)新的(de)(de)HPLC都是(shi)(shi)UHPLC了。
HPLC色譜柱和固定相的發展
HPLC色譜(pu)柱(zhu)(zhu)(zhu)是(shi)(shi)色譜(pu)系統的(de)核心。在(zai)堿性(xing)分析物分析方面，制藥業一直是(shi)(shi)HPLC色譜(pu)柱(zhu)(zhu)(zhu)向高(gao)(gao)速、高(gao)(gao)分辨率、更好的(de)峰(feng)形發(fa)展的(de)主要驅(qu)動(dong)力。此(ci)外,QC實驗室已經被(bei)要求(qiu)改(gai)進色譜(pu)柱(zhu)(zhu)(zhu)的(de)批次重(zhong)現(xian)性(xing)。從70年(nian)代到90年(nian)代,在(zai)填充材料的(de)標準顆粒尺度(du)(10-3μm)的(de)逐級(ji)縮小方面已經有(you)(you)穩定的(de)改(gai)進。80年(nian)代后期，高(gao)(gao)純(chun)度(du)B型硅材料(低(di)金屬(shu)含(han)量(liang))的(de)引(yin)入是(shi)(shi)一個巨大進步,減少了硅醇的(de)活性(xing)，并在(zai)批次間(jian)的(de)一致性(xing)方面有(you)(you)重(zhong)大改(gai)進。現(xian)在(zai)高(gao)(gao)純(chun)硅的(de)使用(yong)是(shi)(shi)所有(you)(you)現(xian)代硅膠基質(zhi)色譜(pu)柱(zhu)(zhu)(zhu)的(de)標準。
圖3 UHPLC 高分辨率(lv)分離(li)(C18色(se)譜(pu)柱，填充(chong)亞2μm顆粒)。(A)銀杏標準(zhun)化提取物的(de)色(se)譜(pu)圖。梯度：5%到40%的(de)乙(yi)腈，120分鐘，T=30°C, Lcol = 300mm，F = 0.2 mL/min,ΔPmax = 860 bar,峰(feng)(feng)容量(liang)可以(yi)達(da)到360；(B)三種蛋(dan)白質的(de)結合(he)胰蛋(dan)白酶消化酶的(de)色(se)譜(pu)圖。梯度：5%到60%的(de)乙(yi)腈，120min ，T=30°C，Lcol = 40cm,F = 0.16 mL/min,ΔPmax = 940bar,峰(feng)(feng)容量(liang)可以(yi)達(da)到410。
HPLC色(se)譜柱技術的(de)近期進展已經被廣泛地綜(zong)述(已經有很多文獻(xian)綜(zong)述并討論了HPLC的(de)色(se)譜柱技術的(de)近期進展)。表2總結了重大行業使(shi)用率(lv)較高(gao)的(de)，用于提(ti)高(gao)生(sheng)產力、穩定性、選(xuan)擇(ze)性或保留時間(亞2μm,核(he)殼粒子(zi),混合(he)物(wu),新奇的(de)鍵合(he)反應,HILIC)或專(zhuan)業應用 (手(shou)性化(hua)合(he)物(wu)或生(sheng)物(wu)分子(zi))的(de)色(se)譜柱。
表2 影響(xiang)藥物(wu)分析的重要的HPLC色譜柱的研(yan)究進展
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HPLC色譜柱重要研究進展 |
評論 |
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亞(ya)2μm顆粒 |
全孔亞2μm顆粒(li)產生較低(di)的塔板高度和高的塔板效率。10多家(jia)供應商提供超過80種可用的化學(xue)反應，包括離子交換、尺寸排阻(zu)等(deng)。 |
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亞3μm核殼顆(ke)粒 |
表(biao)面多孔型亞-3μm顆(ke)粒在低(di)柱壓(ya)條件下(xia)提供改(gai)善的質(zhi)量傳遞和較低(di)的塔板高度。增加了在藥(yao)物(wu)分析中的使(shi)用案(an)例(li)。 |
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混合硅(gui)顆粒 |
創新的顆粒(li)提高色譜(pu)柱的化(hua)學穩定性（擴大pH范圍(wei)、溫度(du)和壓力性能(neng)，親硅醇(chun)基活(huo)性） |
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新奇的鍵合化學反應 |
多(duo)官能團的硅烷化學、極性嵌入(ru)式鍵(jian)合(he)相(xiang)、五氟苯酚(fen)（PFP）、 苯基(ji)-己基(ji)、表(biao)面(mian)帶電雜化（CSH）相(xiang)，提(ti)供“正交”分離和增強的選擇(ze)性（與傳統的C18鍵(jian)合(he)相(xiang)相(xiang)比(bi)） |
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親水作(zuo)用(yong)色譜（HILIC） |
反相(xiang)色(se)譜的“正(zheng)交”分離對(dui)強極性化(hua)合物(wu)和次生代謝物(wu)有用 |
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用于手性分離的多糖固(gu)定相 |
多(duo)糖手性固定(ding)相使得(de)通常的色譜柱具有(you)多(duo)用性和抗造性 |
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生物分子色譜柱 |
創新的核(he)殼結構和(he)UHPLC大孔徑固定相可(ke)以(yi)有效改善蛋白質和(he)治療性生物分子（如(ru)mAbs）的分析(xi)。 |
亞2 μm顆粒
1956年，Van Deemter就(jiu)給出了使用非常小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)進行(xing)快速、高效分(fen)離的(de)(de)(de)預(yu)測。在過(guo)去五年中(zhong)，典型填料的(de)(de)(de)粒(li)徑(jing)在不斷(duan)的(de)(de)(de)減(jian)(jian)小(xiao)(xiao)，二十一(yi)世(shi)紀(ji)初，集中(zhong)在亞(ya)2μm的(de)(de)(de)硅微顆(ke)粒(li)。正如預(yu)測的(de)(de)(de)那樣(yang),這些粒(li)子(zi)(例(li)如,1.7μm)產生卓越(yue)的(de)(de)(de)性(xing)能(~ 280000 plates/m或~ 4μm/plate)。然而(er),填充亞(ya)2μm粒(li)子(zi)的(de)(de)(de)色譜柱(zhu)(zhu)產生高的(de)(de)(de)背壓，通常填充內徑(jing)為2.1毫米，通過(guo)粘性(xing)發熱減(jian)(jian)少(shao)效率損失(shi)。對(dui)高壓力(li)和低分(fen)散(減(jian)(jian)少(shao)附(fu)加(jia)柱(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)譜帶(dai)展寬)系(xi)統的(de)(de)(de)要求導(dao)致了現代UHPLC系(xi)統的(de)(de)(de)當前特點。進一(yi)步降低粒(li)徑(jing)至小(xiao)(xiao)于1.5μm可能會產生更(geng)高的(de)(de)(de)速度和性(xing)能。然而(er),它也(ye)必須(xu)伴隨(sui)著(zhu)系(xi)統壓力(li)的(de)(de)(de)大幅增加(jia)和毛細管色譜柱(zhu)(zhu)內徑(jing)的(de)(de)(de)減(jian)(jian)小(xiao)(xiao)。
核殼結構顆粒
Kirkland第一次描述了熔融(rong)的(de)(de)(de)核(he)或(huo)(huo)者(zhe)核(he)殼粒(li)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)概念，減少質(zhi)量(liang)轉(zhuan)移(yi)過程中(zhong)的(de)(de)(de)阻(zu)力(li)。第一個核(he)殼粒(li)子(zi)(zi)(zi)具(ju)(ju)有(you)如下特點:2.7μm表面多(duo)(duo)孔(kong)硅材料，無(wu)孔(kong)的(de)(de)(de)核(he)心(1.7μm)，多(duo)(duo)孔(kong)的(de)(de)(de)殼層(厚0.5μm)。這些亞(ya)(ya)3 μm的(de)(de)(de)顆粒(li)與(yu)亞(ya)(ya)2μm的(de)(de)(de)完全多(duo)(duo)孔(kong)材料相(xiang)(xiang)(xiang)比似(si)乎具(ju)(ju)有(you)相(xiang)(xiang)(xiang)似(si)的(de)(de)(de)效率，但是(shi)可以產(chan)生更低的(de)(de)(de)壓降。這種(zhong)特殊的(de)(de)(de)性能(neng)可能(neng)是(shi)由于殼體較(jiao)短的(de)(de)(de)擴散路徑，或(huo)(huo)者(zhe)比較(jiao)狹窄的(de)(de)(de)填(tian)料分布。由于快速分離(HIS、IPC和清(qing)潔驗證(zheng))和在生物分子(zi)(zi)(zi)方面的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)，核(he)殼色(se)譜(pu)柱(zhu)迅(xun)速獲得廣(guang)泛的(de)(de)(de)接受。越來越多(duo)(duo)的(de)(de)(de)制(zhi)造商(shang)可以提供各種(zhong)鍵(jian)合相(xiang)(xiang)(xiang)和不同尺寸的(de)(de)(de)粒(li)子(zi)(zi)(zi)(1.3,1.7,2.6,1.3和5μm)。我們完全相(xiang)(xiang)(xiang)信(xin)，與(yu)多(duo)(duo)孔(kong)微細顆粒(li)的(de)(de)(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)相(xiang)(xiang)(xiang)比，這些色(se)譜(pu)柱(zhu)在所有(you)應(ying)用(yong)中(zhong)具(ju)(ju)有(you)很(hen)大的(de)(de)(de)競爭力(li)。
圖4 10種(zhong)具有(you)酸性、堿(jian)性和(he)(he)中性官能團的商品(pin)化藥物(wu)在BEH和(he)(he)CSH分析柱的分析比較(jiao)，梯度洗(xi)脫，流動相含乙腈和(he)(he)0.1%的甲酸。峰1、4、6和(he)(he)8是基(ji)本藥物(wu)。從文(wen)獻中復印,已取得(de)許可。
雜化
將有(you)(you)機(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)引入(ru)到(dao)無機(ji)(ji)硅基(ji)(ji)體(ti)中(zhong)形(xing)成雜交顆粒的(de)(de)(de)(de)(de)理(li)念在上(shang)世(shi)紀70年(nian)代首(shou)次(ci)由Unger提(ti)出(chu)，雖然第一根(gen)具(ju)(ju)有(you)(you)甲(jia)基(ji)(ji)基(ji)(ji)團(tuan)的(de)(de)(de)(de)(de)商(shang)業化的(de)(de)(de)(de)(de)色譜柱在1999年(nian)才(cai)正式推(tui)出(chu)。這些混合(he)物中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)鍵(jian)合(he)相(xiang)被證明具(ju)(ju)有(you)(you)很(hen)好的(de)(de)(de)(de)(de)pH穩定(ding)性(xing)(具(ju)(ju)有(you)(you)新奇的(de)(de)(de)(de)(de)鍵(jian)合(he)化學反(fan)應的(de)(de)(de)(de)(de)pH范圍為1到(dao)12,而傳統的(de)(de)(de)(de)(de)具(ju)(ju)有(you)(you)常(chang)規單功(gong)能(neng)鍵(jian)合(he)硅顆粒的(de)(de)(de)(de)(de)pH范圍為2-8),低的(de)(de)(de)(de)(de)親(qin)硅羥基(ji)(ji)活性(xing)。2005年(nian)，引入(ru)第二代橋聯乙烯雜化 (BEH)，并立即獲得了“主流”成功(gong),特(te)別是高pH值(zhi)流動相(xiang)以及UHPLC的(de)(de)(de)(de)(de)應用方(fang)面。
新奇的鍵合反應
或許是(shi)因為(wei)批次之間(jian)重(zhong)現(xian)(xian)性最好,傳(chuan)統的(de)(de)(de)單官能(neng)團的(de)(de)(de)C18硅膠基(ji)(ji)質(zhi)鍵合(he)相(xiang)(xiang)(xiang)仍是(shi)主要的(de)(de)(de)產(chan)品,但(dan)是(shi)新的(de)(de)(de)鍵合(he)化學反應(ying)給困難的(de)(de)(de)分(fen)離(li)(極性嵌入式、苯(ben)(ben)基(ji)(ji)、己基(ji)(ji)苯(ben)(ben)基(ji)(ji)、含氰基(ji)(ji)的(de)(de)(de)、戊烷(wan)氟苯(ben)(ben)基(ji)(ji)鍵合(he))帶來了更(geng)寬的(de)(de)(de)pH值穩定(ding)范(fan)圍(多官能(neng)的(de)(de)(de)硅烷(wan)化學鍵或異丙基(ji)(ji)保(bao)護的(de)(de)(de)硅烷(wan))和(he)增強的(de)(de)(de)選(xuan)擇性。最近的(de)(de)(de)一(yi)個創新方法稱(cheng)為(wei)表(biao)面帶電(dian)雜化(CSH)技術(shu)(shu)(shu)，該項技術(shu)(shu)(shu)于(yu)2010年引(yin)(yin)入,由(you)于(yu)在(zai)(zai)酸性,低(di)離(li)子(zi)強度(du)流動(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)條(tiao)件下(xia)，對(dui)高(gao)堿(jian)性分(fen)析物(wu)的(de)(de)(de)峰形的(de)(de)(de)改善，該項技術(shu)(shu)(shu)立即在(zai)(zai)藥物(wu)分(fen)析領域獲得了很(hen)好的(de)(de)(de)接(jie)(jie)受度(du)(如0.1%甲酸)。這項專(zhuan)有(you)技術(shu)(shu)(shu)包括(kuo)在(zai)(zai)固(gu)定(ding)相(xiang)(xiang)(xiang)表(biao)面引(yin)(yin)入低(di)水平(ping)的(de)(de)(de)正電(dian)荷。這類似于(yu)早期在(zai)(zai)流動(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)中添加(jia)有(you)機(ji)胺，如三乙胺，但(dan)由(you)于(yu)離(li)子(zi)抑制(zhi)，已經不被LC/MS接(jie)(jie)受。圖4說明了與現(xian)(xian)在(zai)(zai)的(de)(de)(de)鍵合(he)相(xiang)(xiang)(xiang)相(xiang)(xiang)(xiang)比，CSH顆粒在(zai)(zai)峰形方面表(biao)現(xian)(xian)的(de)(de)(de)優勢。注意(yi),酸性化合(he)物(wu)在(zai)(zai)CSH柱子(zi)上(shang)會有(you)相(xiang)(xiang)(xiang)對(dui)較(jiao)高(gao)的(de)(de)(de)保(bao)留(liu)，峰拖尾現(xian)(xian)象也會有(you)所增加(jia)。
親水作用色譜(HILIC)
在反相(xiang)(xiang)LC(RPLC)條件下，若流(liu)(liu)動相(xiang)(xiang)中有機(ji)物(wu)含量比較(jiao)低，就會導致相(xiang)(xiang)坍塌現象(鍵合相(xiang)(xiang)脫(tuo)水(shui)(shui))，許多強極(ji)性(xing)(xing)化合物(wu)就無(wu)法(fa)獲得足(zu)夠的(de)(de)(de)保留時間或(huo)者會存(cun)在問題。HILIC模(mo)式, 90年代由Alpert首次開發,使(shi)用親(qin)水(shui)(shui)固定相(xiang)(xiang)(硅、二(er)醇、氰基(ji)、氨基(ji)、兩性(xing)(xing)離子的(de)(de)(de))，類似RPLC使(shi)用的(de)(de)(de)水(shui)(shui)緩沖和(he)乙腈流(liu)(liu)動相(xiang)(xiang),在極(ji)性(xing)(xing)藥(yao)物(wu)分析、輔助藥(yao)物(wu)代謝(xie)、氨基(ji)酸、多肽(tai)、神經遞(di)質(zhi)(zhi)、低聚糖(tang)、碳(tan)水(shui)(shui)化合物(wu)、核(he)苷酸或(huo)核(he)苷方面的(de)(de)(de)分析中越來越受歡(huan)迎(ying)。HILIC實際(ji)的(de)(de)(de)保留機(ji)制可(ke)以認為(wei)是分析物(wu)分子“分區”到附著在親(qin)水(shui)(shui)結合基(ji)團的(de)(de)(de)水(shui)(shui)層。與RPLC相(xiang)(xiang)比，HILIC其他突出(chu)的(de)(de)(de)優勢包括“正交(jiao)”選擇性(xing)(xing)(樣品制備兼容兩種模(mo)式),對質(zhi)(zhi)譜具(ju)有更(geng)高的(de)(de)(de)電(dian)噴霧離子化靈敏度(5-15倍(bei)),較(jiao)低的(de)(de)(de)操作壓力。
固定化多糖手性固定相
成功(gong)包覆(fu)的多糖(tang)手性(xing)固定相(CSPs)的改進(jin)版(ban)本(ben)在(zai)2000年代末實現(xian)。與早(zao)期的CSPs具有(you)(you)相似的多功(gong)能，但(dan)是對于腐蝕性(xing)的溶劑具有(you)(you)更(geng)好(hao)的穩定性(xing)劑,可用(yong)于正相,極(ji)性(xing)有(you)(you)機(ji)和反相模式。
用于生物分(fen)子的色譜柱
80年代發展(zhan)起來的(de)(de)大孔徑(jing)硅和(he)聚合物(wu)填料可(ke)有(you)效解(jie)決大型生(sheng)物(wu)分(fen)(fen)(fen)子的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)離(li)。隨著重組(zu)蛋白，如單克隆(long)抗體(mAb)等(deng)生(sheng)物(wu)制藥的(de)(de)出現，質量控制中(zhong)利(li)用HPLC和(he)毛細管(guan)電泳進行詳(xiang)細表征(zheng)的(de)(de)需求(qiu)變得更加緊(jin)迫。最近，亞2μm微(wei)粒(li)和(he)核殼大孔徑(jing)顆粒(li)以(yi)及一些創新(xin)的(de)(de)離(li)子交換(huan)和(he)尺寸排阻等(deng)材料也被證明可(ke)以(yi)有(you)效的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)離(li)這些大分(fen)(fen)(fen)子的(de)(de)生(sheng)物(wu)制劑。
高分辨率質譜(HRMS)，電霧式檢測器(CAD)和自動方法開發系統(AMDS)
在(zai)過去十(shi)年中，其他具有高影響力的進(jin)展主要體現在(zai)HPLC檢測和自動化領域。
高分(fen)辨率質(zhi)譜(HRMS)
HPLC與質譜(pu)的(de)(de)(de)聯用(yong)(yong)(LC / MS)，集(ji)合了(le)HPLC的(de)(de)(de)分離能力(li)和(he)質譜(pu)卓(zhuo)越的(de)(de)(de)靈敏(min)度和(he)選擇性，已被(bei)視為(wei)完美的(de)(de)(de)分析工具。LC/MS是(shi)雜質和(he)降解鑒定,藥(yao)(yao)物(wu)研究(jiu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)高通(tong)量篩選技(ji)(ji)術(shu)(HTS),生(sheng)(sheng)物(wu)分析試驗(yan)(生(sheng)(sheng)物(wu)流(liu)體中(zhong)(zhong)藥(yao)(yao)物(wu)和(he)代謝物(wu)的(de)(de)(de)LC/MS/MS檢測),藥(yao)(yao)物(wu)合成(cheng)工藝放大在線監(jian)測的(de)(de)(de)首(shou)選技(ji)(ji)術(shu)。LC/MS已經成(cheng)為(wei)高效藥(yao)(yao)物(wu)清潔驗(yan)證以及潛在的(de)(de)(de)基(ji)因毒性雜質測定的(de)(de)(de)標準技(ji)(ji)術(shu)平臺(tai)。過去(qu)十年中(zhong)(zhong)，HRMS(如TOF、OrbiTrap MS)和(he)雜化質譜(pu)(如Quadrupole-TOF或ion trap-OrbiTrap)得(de)到了(le)快速發展。HRMS和(he)UHPLC以及二(er)維LC的(de)(de)(de)聯用(yong)(yong)使得(de)代謝組學、蛋(dan)白質組學, De Novo蛋(dan)白測序和(he)生(sheng)(sheng)物(wu)制藥(yao)(yao)表(biao)征(zheng)等領(ling)域的(de)(de)(de)研究(jiu)愈發活躍(yue)。新(xin)興的(de)(de)(de)個性化醫療領(ling)域中(zhong)(zhong)生(sheng)(sheng)物(wu)標志物(wu)測定和(he)疾病診斷的(de)(de)(de)通(tong)用(yong)(yong)技(ji)(ji)術(shu)平臺(tai)也許是(shi)LC/MS最令人興奮的(de)(de)(de)機(ji)會。
電霧(wu)式檢測器(CAD)
缺乏理想的(de)(de)(de)通(tong)用檢(jian)(jian)(jian)測(ce)器常常被(bei)視為HPLC的(de)(de)(de)局限(xian),盡管UV/Vis檢(jian)(jian)(jian)測(ce)器可以(yi)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)具有發色基團的(de)(de)(de)化合物。示(shi)差折光(guang)(guang)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)器不適合梯度洗(xi)脫(tuo)，敏感性不夠(gou)。蒸發光(guang)(guang)散射檢(jian)(jian)(jian)測(ce)器(ELSD)使(shi)用噴霧(wu)器技(ji)(ji)術與激光(guang)(guang)光(guang)(guang)散射檢(jian)(jian)(jian)測(ce)，是(shi)HPLC的(de)(de)(de)一個選擇，也可以(yi)兼容梯度洗(xi)脫(tuo),但最近已經被(bei)CAD(使(shi)用噴霧(wu)器和(he)(he)電(dian)暈放電(dian)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)技(ji)(ji)術)超(chao)越(yue),CAD可以(yi)提供(gong)更好的(de)(de)(de)靈敏度(低(di)至(zhi)ng)和(he)(he)更好的(de)(de)(de)線性。CAD正逐漸成為藥物化學(xue)中(zhong)的(de)(de)(de)HTS、反(fan)應過程監控以(yi)及原(yuan)材料(liao)/輔料(liao)測(ce)試(shi)的(de)(de)(de)主流的(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)器。
自動化HPLC方法體(ti)系(xi)(AMDS)
復雜混合物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HPLC方(fang)法開發是(shi)一(yi)個(ge)很(hen)耗(hao)時的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)工作，因為需要(yao)優化(hua)(hua)很(hen)多操作參數(柱尺(chi)寸，鍵合固定(ding)相(xiang)和(he)(he)(he)(he)流(liu)動相(xiang)A和(he)(he)(he)(he)B(有機溶(rong)劑/緩沖類型(xing)、pH值和(he)(he)(he)(he)離子(zi)(zi)強度(du)(du))的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)類型(xing),梯度(du)(du)洗(xi)脫時間(jian)和(he)(he)(he)(he)梯度(du)(du)范圍,柱溫度(du)(du)、流(liu)量)。一(yi)個(ge)常(chang)(chang)見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)例(li)子(zi)(zi)就是(shi)藥(yao)物(wu)(wu)活性成(cheng)分(fen)(API)穩定(ding)性指(zhi)示(shi)分(fen)析或純度(du)(du)測(ce)定(ding)，其中所有的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)雜質(zhi)和(he)(he)(he)(he)降解產(chan)物(wu)(wu)必須分(fen)離，通過(guo)(guo)UV檢測(ce)器進(jin)行準確的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)定(ding)量。多年以(yi)來，基(ji)于(yu)模(mo)擬、預測(ce)、單純形優化(hua)(hua)、柱/流(liu)動相(xiang)篩選的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)軟(ruan)件(jian)(jian)或自動化(hua)(hua)系統已經(jing)促進(jin)HPLC方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)開發。雖然他們(men)似(si)乎(hu)還(huan)沒有很(hen)普及，但持(chi)(chi)續的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)改進(jin)提高了HPLC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)性能和(he)(he)(he)(he)易用(yong)性。最新進(jin)入(ru)市場(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)一(yi)個(ge)附加軟(ruan)件(jian)(jian)包，兼(jian)容兩個(ge)常(chang)(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)色譜(pu)數據系統。對于(yu)HPLC方(fang)法開發過(guo)(guo)程(cheng)(優化(hua)(hua))中最耗(hao)時的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)部分(fen)，該軟(ruan)件(jian)(jian)利(li)用(yong)用(yong)戶定(ding)義(yi)空間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)自動化(hua)(hua)序(xu)列(lie)(lie)方(fang)法來解決，其中使用(yong)了實驗(yan)設(she)計(ji)(DoE)和(he)(he)(he)(he)質(zhi)量源(yuan)于(yu)設(she)計(ji)(QbD)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)原則。導入(ru)完(wan)整的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列(lie)(lie)結果(guo)之后，該軟(ruan)件(jian)(jian)還(huan)可以(yi)執行統計(ji)分(fen)析，并顯示(shi)最佳條件(jian)(jian)。圖5說明了應用(yong)在我們(men)實驗(yan)室的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)該軟(ruan)件(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)概(gai)念和(he)(he)(he)(he)特征。自DoE 和(he)(he)(he)(he) QbD概(gai)念被接受以(yi)來,最初用(yong)戶表現(xian)出很(hen)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)興(xing)趣。AMDS對致(zhi)力于(yu)早期藥(yao)物(wu)(wu)開發方(fang)法的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實驗(yan)室特別(bie)有用(yong)。例(li)如,為了支(zhi)持(chi)(chi)利(li)用(yong)多手(shou)(shou)性中心的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)復雜藥(yao)物(wu)(wu)分(fen)子(zi)(zi)進(jin)行API合成(cheng)和(he)(he)(he)(he)藥(yao)物(wu)(wu)產(chan)品制造,10-20種具有代表性的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HPLC方(fang)法(原材料(liao)、起始(shi)物(wu)(wu)料(liao)、中間(jian)體、最終的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)原料(liao)藥(yao)和(he)(he)(he)(he)藥(yao)物(wu)(wu)產(chan)品的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)手(shou)(shou)性和(he)(he)(he)(he)手(shou)(shou)性方(fang)法,)接二連三地(di)被開發出來。
圖5 一個全自動(dong)方法開發系統的(de)儀器構(gou)造圖(tu)解，該系統使用QbD軟件和所(suo)得結果的(de)圖(tu)形，顯示最佳分離(白色)的(de)操作范圍設計空(kong)間。
結論
總之, 最近幾年中，HPLC仍然是(shi)一個高(gao)度(du)有(you)活(huo)力的(de)(de)(de)(de)領域，在(zai)儀器、色譜柱(zhu)技(ji)術(shu)、應(ying)用(yong)(yong)等方面有(you)很多創新。醫藥科學(xue)家們最初將(jiang)這些新技(ji)術(shu)應(ying)用(yong)(yong)于(yu)研究、開發(fa)和質(zhi)量控制(zhi)，他們是(shi)這項技(ji)術(shu)的(de)(de)(de)(de)早期采納者，同時也是(shi)受益者。UHPLC在(zai)研究與開發(fa)領域被快(kuai)速(su)(su)的(de)(de)(de)(de)接受，并(bing)逐漸(jian)成為標(biao)準的(de)(de)(de)(de)UHPLC平臺，雖然在(zai)QC實驗室的(de)(de)(de)(de)應(ying)用(yong)(yong)速(su)(su)度(du)慢一些。新的(de)(de)(de)(de)色譜柱(zhu)技(ji)術(shu)可以更(geng)快(kuai)和更(geng)有(you)效的(de)(de)(de)(de)分(fen)析(xi)復雜樣品、手(shou)性(xing)分(fen)子和生(sheng)(sheng)物分(fen)子。最后(hou),UHPLC和2-D LC與高(gao)分(fen)辨率(lv)質(zhi)譜聯用(yong)(yong)技(ji)術(shu)的(de)(de)(de)(de)快(kuai)速(su)(su)進展(zhan)(zhan)，已(yi)經(jing)徹(che)底改變了生(sheng)(sheng)命科學(xue)的(de)(de)(de)(de)研究，并(bing)將(jiang)會(hui)在(zai)臨床診斷方面產生(sheng)(sheng)更(geng)大的(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。這些進展(zhan)(zhan)得到了在(zai)快(kuai)速(su)(su)發(fa)展(zhan)(zhan)的(de)(de)(de)(de)藥物開發(fa)領域工作的(de)(de)(de)(de)分(fen)析(xi)化學(xue)家的(de)(de)(de)(de)歡(huan)迎。
對于(yu)LC在接下(xia)來的(de)(de)(de)幾(ji)年(nian)的(de)(de)(de)發(fa)展前景,一(yi)些創新(xin)的(de)(de)(de)工作(zuo)(zuo)已經被(bei)描述(shu)。就像Jim Jorgenson描述(shu)的(de)(de)(de):“更高的(de)(de)(de)壓力(50000 psi)將使更小的(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)和/或更長的(de)(de)(de)色譜柱(zhu)的(de)(de)(de)使用成為可(ke)能,同(tong)時分(fen)離速度更快，效果也更好(hao)。由于(yu)熱(re)量(liang)的(de)(de)(de)產生(sheng)和耗(hao)散(san)問(wen)題，幾(ji)乎肯定的(de)(de)(de)是(shi)(shi)需(xu)要使用sub-mm孔(毛細管)色譜柱(zhu)。這并不是(shi)(shi)一(yi)件容易的(de)(de)(de)事情,但是(shi)(shi)高速、高分(fen)辨率分(fen)離方面潛在的(de)(de)(de)可(ke)能性是(shi)(shi)誘(you)人(ren)的(de)(de)(de)。”另外,在毛細管中(zhong)填充極其均一(yi)的(de)(de)(de)次微(wei)米二氧化硅粒(li)子可(ke)以用來產生(sheng)遠低(di)于(yu)1μm的(de)(de)(de)塔板高度，并能對蛋白(bai)質(zhi)變異體進行令人(ren)印象深(shen)刻(ke)的(de)(de)(de)分(fen)離。這兩個研究結果還沒有準備好(hao)馬上成為主流分(fen)析工作(zuo)(zuo)或QC，但是(shi)(shi)第(di)一(yi)個結果是(shi)(shi)鼓(gu)舞人(ren)心的(de)(de)(de),因此在這里(li)值得一(yi)提(ti)。
原(yuan)文作者：Michael W. Dong, Ph.D.
Davy Guillarme, Ph.D.
