脂肪酸氣相色譜分析的故事

2015-07-17 作者：瀏覽數(shu)：1573

編者注：傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授生(sheng)于(yu)1930年(nian)(nian)，1953年(nian)(nian)畢(bi)業于(yu)北(bei)京大學(xue)(xue)化學(xue)(xue)系，而(er)后(hou)一直在北(bei)京理工(gong)(gong)大學(xue)(xue)(原北(bei)京工(gong)(gong)業學(xue)(xue)院)從(cong)事教(jiao)學(xue)(xue)與科研工(gong)(gong)作。1958年(nian)(nian)，傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授開始(shi)帶領(ling)學(xue)(xue)生(sheng)初步(bu)進入吸(xi)附(fu)柱(zhu)色(se)譜(pu)和氣(qi)相色(se)譜(pu)的(de)探索;1966到(dao)1976年(nian)(nian)文化大革命的(de)后(hou)期，傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授在干校勞動的(de)間隙，系統地閱讀(du)并翻譯了(le)兩本氣(qi)相色(se)譜(pu)啟蒙書，從(cong)此進入其(qi)后(hou)半生(sheng)一直從(cong)事的(de)事業——色(se)譜(pu)研究。傅(fu)若(ruo)農(nong)教(jiao)授是(shi)我(wo)國老一輩色(se)譜(pu)研究專家(jia)，見證了(le)我(wo)國氣(qi)相色(se)譜(pu)研究的(de)發展，為我(wo)國培養了(le)眾(zhong)多色(se)譜(pu)研究人才。

第一講：傅若農講述氣相色譜技術發展歷史及趨勢

第二講：傅若農：從三家公司GC產品更迭看氣相技術發展

第三講：傅若農：從國產氣相產品看國內氣相發展脈絡及現狀

第四講：傅若農：氣相色譜固定液的前世今生

第五講：傅若農：氣-固色譜的魅力

第六講：傅若農：PLOT氣相色譜柱的誘惑力

第七講：傅若農：酒駕判官——頂空氣相色譜的前世今生

第八講：傅若農：一掃而光——吹掃捕集-氣相色譜的發展

第九講：傅若農：凌空一瞥洞察一切——神通廣大的固相微萃取（SPME）

第十講：傅若農：懸“珠”濟世——單液滴微萃取(SDME)的妙用

第十一講：傅若農：扭轉乾坤——神奇的反應頂空氣相色譜分析

第十二講：擒魔序曲——脂質組學研究中的樣品處理

第十三講：離子液體柱——脂質組學中分離脂肪酸的氣相色譜柱

上一(yi)講我們(men)主要介紹了在脂質組學中對(dui)(dui)脂肪酸(suan)的分析所用(yong)的離子液體毛細管色譜(pu)柱，但是用(yong)氣相色譜(pu)分析脂肪酸(suan)源遠(yuan)流(liu)長，有許(xu)多(duo)故事，了解(jie)一(yi)些過去的故事對(dui)(dui)現在的發展理解(jie)有好處，溫故才可以知新。

　　先講一(yi)下脂(zhi)質組學中常(chang)常(chang)要(yao)研究的(de)血漿(jiang)分(fen)析(xi)，其中一(yi)個重要(yao)的(de)項目(mu)是(shi)分(fen)析(xi)其中的(de)脂(zhi)肪(fang)酸，下面一(yi)個例子，概要(yao)介(jie)紹了血漿(jiang)中脂(zhi)肪(fang)酸的(de)主要(yao)成分(fen)：

　　“雖然(ran)游(you)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)只占血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)中脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)小部(bu)分(fen)，但它代(dai)表一(yi)(yi)類高(gao)度代(dai)謝活(huo)性的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質，脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)組織(zhi)是血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)游(you)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)主要來源(yuan)，其(qi)(qi)分(fen)布(bu)與食物的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)組成密切相(xiang)關。在(zai)正常情(qing)況下從脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)組織(zhi)中釋放脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)與組織(zhi)對能量的(de)(de)(de)需(xu)要緊密相(xiang)連。但是當(dang)代(dai)謝失(shi)調時，這種平(ping)衡被打亂，導致脂(zhi)(zhi)(zhi)解(jie)增加，會釋放出多(duo)于組織(zhi)所(suo)需(xu)要脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)量。健康人經過一(yi)(yi)夜禁(jin)食后血(xue)(xue)(xue)漿(jiang)中含(han)有(you)214 nmol/ml游(you)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)，油酸(suan)(suan)(18:1)的(de)(de)(de)含(han)量最高(gao)，其(qi)(qi)次是棕(zong)櫚酸(suan)(suan)(16:0)和(he)硬脂(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)(suan)(18:0)，這三(san)種酸(suan)(suan)占全部(bu)游(you)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)78%。亞(ya)油酸(suan)(suan)(18:2)和(he)花(hua)生(sheng)四酸(suan)(suan)(20:4) 是主要的(de)(de)(de)多(duo)不飽(bao)和(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)(約占8%)。但是有(you)營養作用的(de)(de)(de)α-亞(ya)麻(ma)酸(suan)(suan)(18:3ω-3)，二(er)十碳五烯(xi)酸(suan)(suan)(20:5, EPA)和(he)二(er)十二(er)碳六(liu)烯(xi)酸(suan)(suan)(22:6, DHA)也(ye)占有(you)一(yi)(yi)定比例，約為(wei)全部(bu)游(you)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)1%。”

1 脂肪酸氣相色譜分析的歷史故事

　　氣相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)被認為是(shi)分(fen)析復雜混合物中脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸的(de)可(ke)(ke)靠方法(fa)(fa)，這一方法(fa)(fa)可(ke)(ke)追述(shu)到上(shang)世紀50年代，氣相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)的(de)出現于脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸的(de)分(fen)析有密(mi)切的(de)關系(xi)，1952年氣相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)發明(ming)人(ren)A. T. James 和 A. J. P. Martin就用(yong)最為原始(shi)的(de)自制(zhi)氣相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)儀分(fen)析小(xiao)(xiao)分(fen)子脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(Biochem J,1952,50:679),他們首次闡明(ming)氣-液(ye)分(fen)配氣相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)的(de)原理，設計了(le)自動滴定檢測脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸的(de)氣相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜(pu)儀。實驗過程中使用(yong)的(de)色(se)(se)譜(pu)柱為玻(bo)璃柱，其內(nei)徑為4mm，長度為5英(ying)尺，固(gu)定相(xiang)(xiang)(xiang)是(shi)把DC 550硅油涂(tu)漬在(zai)硅藻(zao)土Celite 545上(shang)。分(fen)離小(xiao)(xiao)分(fen)子脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸的(de)色(se)(se)譜(pu)如圖1所(suo)示。

圖(tu)1 用自動(dong)滴定計氣相色譜(pu)儀分析小分子脂肪酸(suan)的色譜(pu)圖(tu)

　　分離從(cong)乙酸(suan)到戊酸(suan)的色譜如圖2所示(shi)：

圖(tu) 2 分離從乙酸到戊酸的色譜

　　此(ci)后分析脂肪酸的(de)(de)一個(ge)重大進(jin)步是(shi)把脂肪酸進(jin)行甲酯化(hua)，1956年James和(he)Martin使用(yong)氣體密度檢測器，并把脂肪酸進(jin)行甲酯化(hua)，使用(yong)阿(a)皮(pi)松類高溫潤(run)滑(hua)脂作固定相(xiang)，可以分離(li)(li)分子量大的(de)(de)脂肪酸。圖3 是(shi)分離(li)(li)C5-C13直鏈(lian)和(he)支鏈(lian)脂肪酸甲酯的(de)(de)色譜(pu)圖。

圖(tu) 3 用高沸點潤滑脂分(fen)離C5-C13直鏈和(he)支鏈脂肪酸甲酯(zhi)的色譜(pu)圖(tu)

色譜(pu)柱：在硅藻土載(zai)體上涂漬高沸點潤滑脂；柱溫：197℃；載(zai)氣(qi)：氮氣(qi) 14.1mL/min;

色譜峰: (1) 空氣, (2) n-戊酸甲酯，(3) n-己(ji)酸甲酯, (4) 4-甲基己(ji)酸甲酯,

(5) 6-甲(jia)基(ji)庚酸甲(jia)酯(zhi), (6) n-辛(xin)(xin)酸甲(jia)酯(zhi), (7) 6-甲(jia)基(ji)辛(xin)(xin)酸甲(jia)酯(zhi), (8) n-壬酸甲(jia)酯(zhi),

(9) 8-甲基壬酸(suan)酯(zhi), (10) n-癸(gui)酸(suan)酯(zhi), (11) 8-甲基癸(gui)酸(suan)酯(zhi), (12) 10-甲基十一酸(suan)酯(zhi) ,

（13) n-十(shi)二酸酯(zhi), (14) 10-甲基(ji)十(shi)二酸酯(zhi)

2 脂肪酸氣相色譜分析的發展

　　脂肪(fang)酸的(de)(de)(de)(de)氣(qi)相色譜(pu)分(fen)析由于它(ta)的(de)(de)(de)(de)極(ji)(ji)性和揮(hui)發性不(bu)好(hao)而帶來麻煩，所(suo)以(yi)首先要把(ba)它(ta)的(de)(de)(de)(de)極(ji)(ji)性羰(tang)基(ji)轉化成易于揮(hui)發的(de)(de)(de)(de)非極(ji)(ji)性衍生物(wu)。有(you)多種烷基(ji)化試劑可以(yi)進行羰(tang)基(ji)的(de)(de)(de)(de)衍生化，使用(yong)最多的(de)(de)(de)(de)是進行甲(jia)基(ji)化，特別是使用(yong)氫火焰離子(zi)化監測器(qi)(FID)氣(qi)相色譜(pu)時，尤為(wei)方便普及。但(dan)是使用(yong)FID也有(you)一些不(bu)足之處。絕對的(de)(de)(de)(de)定量(liang)要依(yi)靠(kao)內(nei)標物(wu)的(de)(de)(de)(de)信號強度，經常使用(yong)的(de)(de)(de)(de)內(nei)標物(wu)是十(shi)七酸(而不(bu)是使用(yong)化學和物(wu)理性質與(yu)所(suo)測定脂肪(fang)酸相近的(de)(de)(de)(de)同位(wei)素標記脂肪(fang)酸混合(he)物(wu)作內(nei)標)。人類體內(nei)不(bu)能合(he)成奇數碳鏈的(de)(de)(de)(de)脂肪(fang)酸(包括碳17酸)，但(dan)是人們可以(yi)通(tong)過食物(wu)攝取它(ta)們，它(ta)們存在(zai)于血液的(de)(de)(de)(de)血漿中(zhong)，增加內(nei)標物(wu)十(shi)七酸的(de)(de)(de)(de)量(liang)，從(cong)而擾(rao)亂定量(liang)分(fen)析。

　　進(jin)一步講，FID不(bu)能提(ti)供分(fen)(fen)子質量或其他結構(gou)特征信息，以(yi)(yi)便區分(fen)(fen)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，所以(yi)(yi)色(se)譜(pu)和FID只(zhi)是(shi)解決把所有要研(yan)究(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)分(fen)(fen)子完全分(fen)(fen)離(li)開，用(yong)(yong)(yong)質譜(pu)解決脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)結構(gou)信息。大家(jia)應該知(zhi)道使(shi)用(yong)(yong)(yong)電(dian)子轟擊電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)分(fen)(fen)子很容(rong)易(yi)被打成碎片，通過(guo)這些碎片可以(yi)(yi)進(jin)行脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)結構(gou)分(fen)(fen)析，但是(shi)靈(ling)敏(min)(min)度受到限制。弱(ruo)電(dian)離(li)技(ji)術比如(ru)(ru)負化(hua)學(xue)電(dian)離(li)(NCI)可以(yi)(yi)改善檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)限。使(shi)用(yong)(yong)(yong)鹵(lu)代衍(yan)生化(hua)試(shi)劑(ji)可以(yi)(yi)進(jin)一步提(ti)高檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)靈(ling)敏(min)(min)度，這種(zhong)(zhong)試(shi)劑(ji)增加了電(dian)子親和力，可改善NCI-MS的(de)(de)(de)(de)靈(ling)敏(min)(min)度。Kawahara 使(shi)用(yong)(yong)(yong)五氟(fu)基芐(xia)(PFB) 作衍(yan)生化(hua)試(shi)劑(ji)來衍(yan)生化(hua)有機羧(suo)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，這樣的(de)(de)(de)(de)含氟(fu)衍(yan)生物電(dian)子很容(rong)易(yi)被俘獲。此后這一方(fang)法擴展到脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)衍(yan)生化(hua)為脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯，與脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)甲酯相比，它很容(rong)易(yi)被NCI-MS檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)。所以(yi)(yi)使(shi)用(yong)(yong)(yong)五氟(fu)基芐(xia)進(jin)行衍(yan)生化(hua)有利于提(ti)高檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)靈(ling)敏(min)(min)度。許多研(yan)究(jiu)(jiu)者使(shi)用(yong)(yong)(yong)PFB做衍(yan)生化(hua)試(shi)劑(ji)進(jin)行脂(zhi)(zhi)質組學(xue)中的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)分(fen)(fen)析，例(li)如(ru)(ru)Quehenberger等就是(shi)用(yong)(yong)(yong)這一方(fang)法分(fen)(fen)析巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)中的(de)(de)(de)(de)各種(zhong)(zhong)脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(Prostaglandins, Leukotrienesand Essential Fatty Acids，2008，79：123–129)。下圖4 是(shi)分(fen)(fen)析巨(ju)噬(shi)細(xi)胞(bao)中的(de)(de)(de)(de)各種(zhong)(zhong)脂(zhi)(zhi)肪(fang)(fang)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)色(se)譜(pu)圖。

圖 4 巨噬(shi)細(xi)胞中的(de)(de)各(ge)種脂肪酸的(de)(de)色(se)譜(pu)圖

圖中(zhong)色譜峰(feng)的脂肪(fang)酸(suan)如下：

(1)12:0; (2)14:0; (3)15:0; (4)16:1; (5)16:0; (6)17:1; (7)17:0;(8) a18:3; (9) 18:4; (10) g18:3; (11)18:2; (12)18:1; (13)18:0; (14)20:4;(15)20:5; (16)11,14,17–20:3;(17)bishomo-20:3; (18)20:2; (19)5,8,11–20:3; (20)20:0; (21)22:6; (22)22:4; (23)22:5; (24)22:2;(25)22:3; (26)22:1; (27)22:0; (28) 23:0; (29)24:1; (30)24:0;

3 國內外進行氣相色譜分析脂肪酸的一些例證

　　為了(le)進(jin)一步了(le)解進(jin)行氣相色譜(pu)(pu)分(fen)析(xi)脂(zhi)肪酸的具(ju)體(ti)情況，下面(mian)表1列出近(jin)50例分(fen)析(xi)各種樣品中(zhong)(zhong)脂(zhi)肪酸的色譜(pu)(pu)柱和分(fen)離對象。表2列出國外文獻中(zhong)(zhong)分(fen)析(xi)人體(ti)組織中(zhong)(zhong)脂(zhi)肪酸的例證。

表 1 國內氣相色譜分(fen)析脂肪酸的色譜柱和分(fen)析對象(xiang)

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表 2 國外文獻中有關分析人體組織中脂肪酸的衍生化方法和所(suo)用(yong)色譜柱

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4 脂肪酸氣相色譜分析所用色譜柱

　　從已發表的(de)文獻(xian)看分(fen)(fen)析整體脂肪酸(suan)需(xu)用非極(ji)性(xing)的(de)聚硅(gui)氧烷毛(mao)細管色(se)譜柱，如聚二甲(jia)基(ji)硅(gui)氧烷，分(fen)(fen)離(li)多不飽和(he)脂肪酸(suan)需(xu)用極(ji)性(xing)強(qiang)的(de)色(se)譜柱，如OV-275，OV-275(這是(shi)聚硅(gui)氧烷固定(ding)相中極(ji)性(xing)最(zui)強(qiang)的(de)色(se)譜柱)和(he)CP-Sil 88(HP-88)。據安捷倫公司一份研究報告(5989-3760 EN)，他們對(dui)最(zui)重要的(de)一些脂肪酸(suan)(甲(jia)酯)(見表3)進行研究，研究總(zong)結認為：聚乙(yi)二醇柱對(dui)不太(tai)復雜的(de)樣品(pin)可(ke)以(yi)得到(dao)很(hen)好(hao)的(de)分(fen)(fen)離(li);而(er)中等極(ji)性(xing)的(de)氰丙(bing)基(ji)聚硅(gui)氧烷柱(DB 23)對(dui)復雜的(de) FAMEs 樣品(pin)可(ke)以(yi)得到(dao)很(hen)好(hao)的(de)分(fen)(fen)離(li)，對(dui)一些順(shun)(shun)反(fan)異構體也可(ke)以(yi)得到(dao)分(fen)(fen)離(li); 要使(shi)順(shun)(shun)反(fan)異構體分(fen)(fen)離(li)的(de)更好(hao)，就要使(shi)用更高極(ji)性(xing)的(de) HP-88 氰丙(bing)基(ji)色(se)譜柱。

表3 重要的一些脂肪(fang)酸(suan)

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