檢驗方法驗證的基(ji)本(ben)內(nei)容包括方案的起草及審(shen)批，檢測儀器的確認。

適用(yong)性(xing)驗(yan)證（包括(kuo)準(zhun)確度試(shi)驗(yan)、精密(mi)度測定(ding)、線(xian)性(xing)范圍試(shi)驗(yan)、專(zhuan)屬性(xing)試(shi)驗(yan)等）和結(jie)果評價及批準(zhun)四個的方面。

首(shou)先(xian)是制(zhi)定(ding)驗證方案，然(ran)后對大型精密儀(yi)器進行確(que)認(ren)，最關(guan)鍵的一步(bu)是檢驗方法的適用性試驗，最后是檢驗方法評價及批準。

1、驗證(zheng)方案的制定

檢驗方法的(de)驗證方案通(tong)常由質(zhi)量驗證小(xiao)組提(ti)出。根據產(chan)品(pin)的(de)工藝條件、原輔料化學結構、中間體(ti)、分解產(chan)物查(cha)閱有關資料，提(ti)出規(gui)格標準，確定檢查(cha)項(xiang)目，規(gui)定雜質(zhi)限度，即為(wei)質(zhi)量標準草(cao)案。

根據質量標準(zhun)草(cao)案確定檢查和試(shi)驗范圍(wei)，對檢驗方(fang)法擬(ni)定具(ju)體(ti)操作步驟，最后經有關人員(yuan)審(shen)批方(fang)可實施(shi)。

2、大型精密儀(yi)器的確認

分析測試中所用(yong)的檢測儀器(qi)一般可分為三類：

A、普通儀器：崩解儀，折光儀、分析(xi)天平、酸度計、溶點測定(ding)儀、電(dian)導儀等(deng);

B、較精密儀(yi)器(qi)：旋光儀(yi)、永停滴定儀(yi)、費休氏水分(fen)測定儀(yi)、 自動滴定儀(yi)、藥物溶出(chu)度儀(yi)、可見分(fen)光光度計、電泳儀(yi)等；

C、大型精密儀(yi)器：紫外分光光度計(ji)、紅外分光光度計(ji)、氣相(xiang)色譜儀(yi)、高效液(ye)相(xiang)色譜儀(yi)、薄層掃描儀(yi)等。

為了保證(zheng)分析測試數據準確可(ke)靠(kao)，每臺檢測儀器在投入正式使用之(zhi)前(qian)都應進行確認。

檢測(ce)儀(yi)器的確認是(shi)檢驗(yan)(yan)方(fang)法驗(yan)(yan)證的基礎，應在其它驗(yan)(yan)證試驗(yan)(yan)開(kai)始之前首先完(wan)成。

檢測儀器(qi)確認(ren)工作內(nei)容應根據儀器(qi)類型。技術(shu)性(xing)能而定，通常包括：安裝確認(ren)、校正、適用性(xing)預試驗和再確認(ren)。

3、校正(zheng)

校正(zheng)(zheng)是儀器(qi)確認及檢驗(yan)方(fang)法驗(yan)證(zheng)中的(de)一個重(zhong)要環節，應當在驗(yan)證(zheng)試(shi)驗(yan)以前進行校正(zheng)(zheng)。紫外分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)(du)計校正(zheng)(zheng)包括(kuo)波長(chang)校正(zheng)(zheng)、吸收度(du)(du)測(ce)試(shi)、準確度(du)(du)測(ce)試(shi)、雜(za)散光(guang)(guang)檢查。

氣相(xiang)色(se)譜(pu)(pu)(pu)儀與高(gao)效液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)(pu)(pu)儀均要(yao)求(qiu)做系統適用性試驗。在規定(ding)的(de)色(se)譜(pu)(pu)(pu)條(tiao)件(jian)下(xia)測定(ding)色(se)譜(pu)(pu)(pu)柱的(de)最(zui)小(xiao)理論(lun)塔板數。分離度和拖尾因子，并規定(ding)變異系數應不(bu)大于(yu)2％。

對于化學(xue)檢驗中使用的計量(liang)儀器(qi)包括容量(liang)瓶、移(yi)液管、滴定管、分析天平亦均應校正。

4、適(shi)用(yong)性(xing)預試驗

儀器(qi)的安裝(zhuang)確(que)認完成以(yi)后，在其功能試驗符合(he)要求的情況下，應用(yong)標準品(pin)(pin)或(huo)對(dui)照品(pin)(pin)對(dui)其進行適用(yong)性檢查，以(yi)確(que)認儀器(qi)是否符合(he)使用(yong)要求。

例(li)如(ru)對熔點(dian)(dian)測定儀的適用性預(yu)試驗是采用已知(zhi)溶(rong)點(dian)(dian)的甲硝(xiao)唑做試驗，測試結果與已知(zhi)熔點(dian)(dian)比較。

紫(zi)外(wai)分光光度計可用已(yi)知(zhi)含(han)量的某標準(zhun)品試驗，測得結(jie)果與已(yi)知(zhi)數值對比，確定儀器是否符合(he)使用要(yao)求。

在完(wan)成上述(shu)各項試驗工作(zuo)的(de)同(tong)時，應做好相應的(de)文件記錄等資料歸檔工作(zuo)，每一臺儀器均應有一套完(wan)整的(de)檔案資料。

5、再確認

為了確(que)保儀器(qi)處(chu)于良好的(de)(de)使用狀態(tai)，對于一臺新購買的(de)(de)儀器(qi)在(zai)確(que)認(ren)(ren)工作結束以后，應根(gen)據(ju)儀器(qi)的(de)(de)類(lei)別。確(que)認(ren)(ren)的(de)(de)經驗制定再確(que)認(ren)(ren)的(de)(de)計劃(hua)。

再確(que)認的(de)時間間隔和(he)內(nei)容(rong)要根據儀器(qi)類(lei)別和(he)使用(yong)情況決定，一般是(shi)3個月、6個月或1年。

儀器(qi)再確認的內容通常包(bao)括(kuo)線路連接(jie)、附件備品消耗檢查、清潔工(gong)作(zuo)、功能試驗(yan)、工(gong)作(zuo)日記等，其中重點安裝確認中的功能試驗(yan)。

藥品質量標準分析方法驗證的目的是(shi)證明(ming)采用的方法適合(he)于相應的檢測(ce)要求。

在(zai)起草藥品質量標(biao)準時，分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法需(xu)經(jing)驗證：在(zai)藥物(wu)生(sheng)產(chan)方(fang)法變(bian)更、制(zhi)劑的組(zu)分(fen)(fen)變(bian)更、原分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法進行(xing)修訂(ding)時，則質量標(biao)準分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法也(ye)需(xu)進行(xing)驗證。

方法(fa)驗證過程和結(jie)果均應記載在藥品標準(zhun)起草或修訂說明中。

根據《中國藥典》 附錄XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分為三種情況處理；

1、無需驗證的方法。如藥典(包括USP、EP、CP、JP等各國藥典)的方法，一般只做系統適用性試驗，以確認系統是否符合要求(主要指儀器穩定性及柱的分離度是否達標)。

2、對比法。已在參比實驗室驗證過的分析方法，可用對比試驗的方法來確認方法的可靠性，即將本實驗室與參比實驗室用同一方法對同批樣品所測數據進行比較(如至少取五個批號，每批重復測定五次)，判斷方法在本實驗室的可行性。

如有(you)差異需查明原因(yin)或設(she)計方案(an)，對方法進行再驗證。

3、需進行系統驗證的方法。

安裝確(que)認及適用性(xing)試驗結(jie)束后(hou)，應(ying)將試驗數(shu)據資料進行匯總分(fen)析。對檢驗方(fang)法作出正確(que)的(de)評價，驗證報告的(de)說(shuo)明及結(jie)論部(bu)分(fen)應(ying)簡明扼(e)要。

試驗中的主要(yao)偏差(cha)應有(you)適當(dang)解釋。然后，報主管領導(dao)審批。檢驗方法(fa)(fa)驗證的最(zui)終產(chan)物是一個經過驗證的方法(fa)(fa)—根(gen)據驗證的結果制(zhi)訂的由有(you)關領導(dao)批準的檢驗方法(fa)(fa)。

在如何正確或準確地估算檢出限的問題上,國際分析界一直存有爭議。檢出限的特殊意義在于可以對一個給定的分析方法在低濃度水平的檢測能力進行準確地評估，而考察一個分析方法在低濃度范圍的檢測性能，可以基于不同的角度或不同的側重點,如可以從最小信號值與儀器噪音之比來考察，從方法測定空白的平均波動性來統計估算,也可以根據分析方法校準曲線的偏差特性來定量估算等等。

檢出限是評價一個分析方法及測試儀器性能的重要指標,所謂“檢出”是指定性檢出，即判定樣品中存在有濃度高于空白的待測物質。

ACS(美國化學學會)對這一定義作了更簡明的概括:檢出限是一個分析方法能夠可靠地檢測出被分析物的最低濃度。

1、檢測限（limit of detection, LOD）定義(yi):

在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度（量）稱為檢測限，即產生信號（峰高）為基線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時的濃度，對其測定的準確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測限定義為信噪比（S/N）3:1時的濃度。

2、計(ji)算公式為：

D=3N/S （1）

式中：N——噪音; S——檢測器靈敏度；D——檢測限

而靈敏度的計算公式為：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度；I——信號響應值；Q——進樣量

將式（1）和式（2）合并，得到下式：

D=3N×Q/I (3)

式中：Q——進樣量；N——噪音；I——信號響應值。I/N即為該進樣量下的信噪比（S/N），該信噪比可通過工作站對圖譜進行自動分析獲得，一般的色譜或質譜工作站都可進行信噪比分析計算。這樣檢測限的計算方法就變得非常方便了。

3、計算方法：

實際計算時，檢出限有2種表示方法：一種是進樣瓶中樣品檢測限，一種是針對原始樣品的方法檢出限。

A、對第一種檢測限，只要知道進樣量和信噪比即可計算。如進樣瓶中樣品濃度為1 mg/L,在此濃度下的信噪比為300(由工作站分析獲得)，則其檢測限為：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也可用絕對進樣量表示，若進樣體積為10 ul，則其檢測限為：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表示方法，需同時考慮原始樣品的取樣量和提取樣品的定容體積。仍按前述樣品計算，若取樣量為5克，最后定容體積為5 mL，則方法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原始樣品中待檢物質的濃度為0.01mg/kg時，若取樣量為5g,樣品經前處理后定容體積為5mL時,進樣瓶中樣品的濃度可達0.01mg/L（假定回收率為100%）,此時，在其它給定的分析條件下，能產生3倍噪聲強度的信號。在實際檢測工作中，第二種表示方法更為常見。

4、注(zhu)意(yi)事項(xiang)

由式（3）可見，信噪比的大小直接關系到檢測限的大小。信噪比計算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計算信噪比時基線噪聲峰值的定義方式有關，一般有三種不同的定義：

A、峰/峰（peak to peak）信噪比，用某一段基線噪聲的平均高度；

B、峰/半峰（half peak to peak）信噪比, 用某一段基線噪聲平均高度的1/2；

C、均方根（RMS）信噪比，用某一段基線噪聲的均方根值計算。

除(chu)此(ci)之外，信噪(zao)(zao)(zao)比的(de)計算(suan)結(jie)果還和所取(qu)噪(zao)(zao)(zao)聲(sheng)的(de)位置有(you)很(hen)大關(guan)系，取(qu)信號哪一(yi)(yi)側基(ji)線的(de)噪(zao)(zao)(zao)聲(sheng)，取(qu)多(duo)長一(yi)(yi)段(duan)基(ji)線上的(de)噪(zao)(zao)(zao)聲(sheng)，計算(suan)結(jie)果都很(hen)不完全相同，有(you)時相差甚遠。一(yi)(yi)般多(duo)取(qu)樣品(pin)峰兩(liang)側的(de)噪(zao)(zao)(zao)聲(sheng)峰值計算(suan)。

5、檢出(chu)限的確定

A、《全球環境監測系統水監測操作指南》中規定：給定置信水平為95%時，樣品測定值與零濃度樣品的測定值有顯著性差異即為檢出限：

L = 4.6Sb

式中：L——方法的最低檢出濃度。

Sb ——測定次數為n次的空白平行測定（批內）標準差（重復測定20次以上）。

B、國際純粹和應用化學聯合會（IUPAC）規定對各種光學分析方法，可用下式計算：

L = KSb/S

L——方法的最低檢出濃度

Sb——空白多次測量的標準偏差（吸光度）；

S ——方法的靈敏度（即校準曲線的斜率）

為了評估 ，空白測定次數必須足夠多，最好能測20次。國際純粹和應用化學聯合會極力提倡取k值為3，一般來說，取 相應的置信水平大約為90%。

若 =0，并不意味著 ，或檢出限無限小。這時需配制一個濃度略大于零濃度的試樣系列（能產生一個可測信號值）代替全程序空白試驗，求出其標準偏差，用來代替 。

此外，有時為了工作方便和便于比較，也規定一個大家能接受的信號值作為檢出限，如分光光度法中，規定吸光度為0.010所對應的濃度即為檢出限L。

C、 美國EPA SW—846規定方法中的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分光光度法是以吸光度（扣除空白）為0.010相對應的濃度值或絕對量為檢出限，這是一種實驗室間的協定方案。

E、氣相色譜法：檢測器恰能產生與噪音相區別的響應信號時所需進入色譜的物質最小量為檢出限，一般為噪音的二倍。

F、離子選擇電極法：當校準曲線的直線部分外延的延長線與通過空白電位且平行于濃度軸的直線相交時，其交點所對應的濃度值即為該離子色譜所對電極法的檢出限。

由測得的空白值計算出的L值不應大于分析方法規定的最低檢出濃度值，如大于方法規定值時，必須尋找原因降低空白值，重新測定計算至合格。

6、校正(zheng)曲線繪制：

A、按分析方法步驟，通過實測濃度和儀器信號值的直線關系，確定實驗室條件下的測定上限。當測定上限低于方法的檢測上限時，只能用實測的直線范圍。

B、繪制校正曲線的分析步驟應與樣品分析相同，并且不少于5個濃度值。

C、校正曲線繪制與每批測定樣品同時進行，對某些分析方法的校正曲線的斜率穩定，批間誤差較小，使用原制校正曲線時，應與樣品同時測定2份中等濃度標樣和2份空白的平行樣。

測得標準的濃度（減去空白）值與原校正曲線相對應的濃度值的相對偏差，分光光度應小于5%；原子吸收法應小于10%，否則重新制作校正曲線。

最后還要特(te)別強(qiang)調，檢出(chu)(chu)限(xian)和(he)(he)測(ce)定(ding)下(xia)(xia)限(xian)是(shi)兩個(ge)不(bu)同(tong)的(de)概(gai)念，它們是(shi)評(ping)價一個(ge)分析(xi)方(fang)法及測(ce)試儀器性能(neng)的(de)重(zhong)要指標，檢出(chu)(chu)限(xian)是(shi)一個(ge)定(ding)性概(gai)念，而測(ce)定(ding)下(xia)(xia)限(xian)是(shi)一個(ge)定(ding)量(liang)(liang)概(gai)念，搞清楚兩者概(gai)念和(he)(he)相(xiang)互(hu)關系，可提高(gao)色(se)譜分析(xi)中(zhong)檢測(ce)結(jie)果(guo)的(de)準確性和(he)(he)可靠(kao)性，特(te)別在痕量(liang)(liang)分析(xi)中(zhong)，檢出(chu)(chu)限(xian)和(he)(he)測(ce)定(ding)下(xia)(xia)限(xian)的(de)確定(ding)對于(yu)分析(xi)方(fang)法的(de)選擇具(ju)有(you)重(zhong)要意義(yi)，同(tong)樣的(de)，對于(yu)實驗(yan)室(shi)質(zhi)量(liang)(liang)控制也具(ju)有(you)很重(zhong)要的(de)意義(yi)。