檢(jian)驗方法驗證的基(ji)本(ben)內容包括方案的起草及審(shen)批，檢(jian)測儀器的確(que)認。

適用性(xing)驗證(zheng)（包(bao)括準(zhun)確度試驗、精(jing)密(mi)度測定、線性(xing)范圍試驗、專(zhuan)屬(shu)性(xing)試驗等(deng)）和結果評價及批(pi)準(zhun)四個的方面。

首(shou)先是制定驗(yan)(yan)證(zheng)方案，然(ran)后(hou)對大型精(jing)密儀器進行確(que)認，最(zui)關鍵(jian)的(de)一步是檢驗(yan)(yan)方法的(de)適用性試驗(yan)(yan)，最(zui)后(hou)是檢驗(yan)(yan)方法評價及批準。

1、驗證方案(an)的制定

檢(jian)(jian)驗(yan)方法的驗(yan)證(zheng)方案通常(chang)由質量(liang)驗(yan)證(zheng)小組提(ti)出(chu)。根據產品的工藝條件(jian)、原輔料化(hua)學結構、中間(jian)體、分解產物查(cha)閱有關資料，提(ti)出(chu)規格標準，確定檢(jian)(jian)查(cha)項目，規定雜質限度，即為質量(liang)標準草案。

根據質量標準草案確定(ding)檢查和試(shi)驗(yan)范(fan)圍，對檢驗(yan)方(fang)法擬定(ding)具體操(cao)作步驟，最后經有關(guan)人員審(shen)批(pi)方(fang)可實施(shi)。

2、大型精密儀(yi)器的確認

分析測試中所用的(de)檢測儀(yi)器一般可分為(wei)三(san)類(lei)：

A、普(pu)通(tong)儀器(qi)：崩解儀，折(zhe)光儀、分析天平、酸度(du)計、溶點測定儀、電(dian)導儀等;

B、較精密儀(yi)(yi)(yi)器：旋光(guang)(guang)儀(yi)(yi)(yi)、永停滴定(ding)儀(yi)(yi)(yi)、費休氏水分測定(ding)儀(yi)(yi)(yi)、 自動滴定(ding)儀(yi)(yi)(yi)、藥物溶出度儀(yi)(yi)(yi)、可見分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計、電泳儀(yi)(yi)(yi)等；

C、大型精密(mi)儀器(qi)：紫外分(fen)光(guang)光(guang)度計、紅外分(fen)光(guang)光(guang)度計、氣(qi)相(xiang)色(se)譜(pu)儀、高效液相(xiang)色(se)譜(pu)儀、薄層(ceng)掃描儀等(deng)。

為了(le)保證分析測(ce)試數據準確可靠，每臺檢測(ce)儀器在投入正式使用(yong)之前都應進(jin)行確認。

檢測儀器的(de)確認是檢驗方法驗證(zheng)的(de)基礎，應在其它(ta)驗證(zheng)試驗開始(shi)之前首先完成。

檢測儀(yi)器確認(ren)工作(zuo)內容應根據(ju)儀(yi)器類型。技術性能而(er)定，通(tong)常包括：安(an)裝(zhuang)確認(ren)、校正(zheng)、適用性預試驗和再確認(ren)。

3、校(xiao)正(zheng)

校(xiao)正(zheng)是儀(yi)器確認及檢驗方法(fa)驗證中(zhong)的一個重(zhong)要環節，應當在驗證試(shi)驗以前進(jin)行校(xiao)正(zheng)。紫外分光(guang)光(guang)度計(ji)校(xiao)正(zheng)包括波長(chang)校(xiao)正(zheng)、吸(xi)收(shou)度測試(shi)、準確度測試(shi)、雜散光(guang)檢查。

氣相(xiang)(xiang)色譜儀與高(gao)效(xiao)液相(xiang)(xiang)色譜儀均要求做系統適用性試驗。在(zai)規定的色譜條(tiao)件下測定色譜柱的最小理(li)論(lun)塔板數。分(fen)離度和拖(tuo)尾(wei)因子，并規定變(bian)異系數應不大于(yu)2％。

對(dui)于化學檢驗中(zhong)使用(yong)的計(ji)量(liang)儀(yi)器包括容量(liang)瓶、移液管(guan)、滴(di)定管(guan)、分析天平(ping)亦(yi)均應校正。

4、適(shi)用(yong)性預試驗

儀器(qi)的安(an)裝(zhuang)確(que)認完成以后，在其(qi)功(gong)能(neng)試驗符(fu)合要(yao)求的情況下，應用標準(zhun)品(pin)或對(dui)照品(pin)對(dui)其(qi)進行適用性檢查，以確(que)認儀器(qi)是(shi)否(fou)符(fu)合使用要(yao)求。

例如對熔點測定儀的適用性預試驗(yan)是采用已(yi)(yi)知溶點的甲(jia)硝唑做(zuo)試驗(yan)，測試結果(guo)與已(yi)(yi)知熔點比較。

紫外分光(guang)光(guang)度計可用已知(zhi)含量的某標準(zhun)品試驗，測得結果與已知(zhi)數值對(dui)比，確定儀器(qi)是否符合使用要求。

在完成上述各項試驗工作的(de)同時(shi)，應(ying)(ying)做好相應(ying)(ying)的(de)文件記錄等資料(liao)歸檔工作，每(mei)一臺儀器均(jun)應(ying)(ying)有一套完整的(de)檔案資料(liao)。

5、再確認(ren)

為了(le)確保儀(yi)器處于良(liang)好(hao)的使用狀(zhuang)態，對于一臺新購買的儀(yi)器在確認工作(zuo)結束以后，應(ying)根據儀(yi)器的類(lei)別。確認的經驗制(zhi)定再確認的計(ji)劃。

再確認的時間(jian)間(jian)隔和內容(rong)要根(gen)據儀器(qi)類別和使用情況(kuang)決定，一(yi)般是3個月、6個月或1年(nian)。

儀器再確認的(de)內容通常包括線路連接、附件備品(pin)消耗檢(jian)查、清潔工(gong)作、功能(neng)試驗、工(gong)作日記等(deng)，其中(zhong)(zhong)重點安裝確認中(zhong)(zhong)的(de)功能(neng)試驗。

藥品(pin)質(zhi)量標準(zhun)分析(xi)方法(fa)驗證的(de)(de)目(mu)的(de)(de)是(shi)證明(ming)采(cai)用的(de)(de)方法(fa)適(shi)合于相(xiang)應的(de)(de)檢測要求。

在起(qi)草藥(yao)品質(zhi)(zhi)量標準時(shi)(shi)，分(fen)(fen)析方(fang)法需(xu)經(jing)驗(yan)證(zheng)：在藥(yao)物生產方(fang)法變更、制劑的(de)組分(fen)(fen)變更、原分(fen)(fen)析方(fang)法進行修訂時(shi)(shi)，則質(zhi)(zhi)量標準分(fen)(fen)析方(fang)法也需(xu)進行驗(yan)證(zheng)。

方(fang)法驗證過(guo)程(cheng)和結果均應記載在藥品標(biao)準起草(cao)或修訂說明中(zhong)。

根據《中國藥典》附錄XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分為三種情況處理；

1、無需驗證的(de)方(fang)法。如藥典（包括(kuo)USP、EP、CP、JP等各(ge)國藥典)的(de)方(fang)法，一般只做(zuo)系(xi)統適用性(xing)試驗，以確認系(xi)統是否符(fu)合(he)要(yao)求(主要(yao)指儀器穩(wen)定性(xing)及柱的(de)分離度是否達標）。

2、對(dui)比法(fa)。已在參(can)比實(shi)驗室(shi)(shi)驗證過的分析(xi)方(fang)法(fa)，可(ke)用對(dui)比試驗的方(fang)法(fa)來確(que)認方(fang)法(fa)的可(ke)靠性，即(ji)將(jiang)本(ben)實(shi)驗室(shi)(shi)與參(can)比實(shi)驗室(shi)(shi)用同(tong)(tong)一方(fang)法(fa)對(dui)同(tong)(tong)批(pi)(pi)樣品所測(ce)數據進行比較(如至少取五個批(pi)(pi)號，每(mei)批(pi)(pi)重復測(ce)定五次(ci))，判(pan)斷方(fang)法(fa)在本(ben)實(shi)驗室(shi)(shi)的可(ke)行性。

如有差(cha)異需(xu)查明原(yuan)因或(huo)設計方案(an)，對(dui)方法進行再驗證。

3、需進行系統驗證的(de)方法。

安裝確認及適用性(xing)試驗結束后，應將試驗數據資料進行匯總分(fen)析。對檢驗方法(fa)作出(chu)正確的評價，驗證報告的說(shuo)明及結論部(bu)分(fen)應簡明扼要(yao)。

試驗(yan)(yan)中的(de)主要偏差應有適(shi)當(dang)解釋。然后(hou)，報主管領(ling)導審批。檢驗(yan)(yan)方(fang)法(fa)驗(yan)(yan)證的(de)最終(zhong)產(chan)物是一個經過驗(yan)(yan)證的(de)方(fang)法(fa)—根據驗(yan)(yan)證的(de)結果制(zhi)訂的(de)由(you)有關領(ling)導批準的(de)檢驗(yan)(yan)方(fang)法(fa)。

在(zai)(zai)如(ru)何(he)正(zheng)確(que)或準(zhun)確(que)地估(gu)算(suan)檢出限(xian)的(de)(de)(de)(de)問題(ti)上,國際分(fen)(fen)析(xi)界一直存有爭(zheng)議。檢出限(xian)的(de)(de)(de)(de)特殊(shu)意義在(zai)(zai)于可(ke)以(yi)對一個(ge)給定的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)析(xi)方法在(zai)(zai)低濃度水平的(de)(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)能力進行準(zhun)確(que)地評估(gu)，而考察(cha)一個(ge)分(fen)(fen)析(xi)方法在(zai)(zai)低濃度范圍的(de)(de)(de)(de)檢測(ce)(ce)性能，可(ke)以(yi)基于不同的(de)(de)(de)(de)角(jiao)度或不同的(de)(de)(de)(de)側重點(dian),如(ru)可(ke)以(yi)從最(zui)小信號值與儀器噪音之比來(lai)考察(cha)，從方法測(ce)(ce)定空白(bai)的(de)(de)(de)(de)平均波(bo)動(dong)性來(lai)統計估(gu)算(suan),也(ye)可(ke)以(yi)根據(ju)分(fen)(fen)析(xi)方法校準(zhun)曲線的(de)(de)(de)(de)偏(pian)差特性來(lai)定量估(gu)算(suan)等等。

檢(jian)出限是評價一個分析(xi)方法及(ji)測試儀器性能的重要指標,所謂“檢(jian)出”是指定性檢(jian)出，即判定樣(yang)品中(zhong)存(cun)在有濃度高于空(kong)白(bai)的待測物質。

ACS(美國化(hua)學學會)對這一(yi)定義作了(le)更簡明的概括:檢出限(xian)是(shi)一(yi)個(ge)分(fen)析方(fang)法能夠(gou)可靠地(di)檢測出被分(fen)析物的最低濃度。

1、檢(jian)測限（limit of detection, LOD）定義

在樣品中能檢出的(de)被(bei)測(ce)組分的(de)最低濃(nong)(nong)度（量）稱為檢測(ce)限(xian)，即產(chan)生(sheng)信(xin)(xin)號（峰高）為基線噪音(yin)標準差k倍(bei)時的(de)樣品濃(nong)(nong)度，一般(ban)為信(xin)(xin)噪比(bi)（S/N）2:1或3:1時的(de)濃(nong)(nong)度，對其測(ce)定的(de)準確度和精密度沒有(you)確定的(de)要(yao)求。目前，一般(ban)將檢測(ce)限(xian)定義為信(xin)(xin)噪比(bi)（S/N）3:1時的(de)濃(nong)(nong)度。

2、計算公式(shi)

D=3N/S （1）

式中：N——噪(zao)音; S——檢(jian)(jian)測(ce)器(qi)靈敏(min)度；D——檢(jian)(jian)測(ce)限

而靈敏度(du)的計(ji)算公式為(wei)：

S=I/Q （2）

式中：S——靈敏度(du)；I——信號響應值；Q——進樣量

將(jiang)式（1）和式（2）合(he)并，得到下式：

D=3N×Q/I (3)

式中：Q——進樣(yang)(yang)量；N——噪(zao)(zao)音；I——信(xin)號響應值。I/N即為該進樣(yang)(yang)量下的(de)(de)信(xin)噪(zao)(zao)比（S/N），該信(xin)噪(zao)(zao)比可通過(guo)工作站對(dui)圖譜(pu)進行自動分析獲得，一般的(de)(de)色譜(pu)或質譜(pu)工作站都(dou)可進行信(xin)噪(zao)(zao)比分析計(ji)算。這樣(yang)(yang)檢(jian)測限(xian)的(de)(de)計(ji)算方(fang)法就變得非常(chang)方(fang)便了(le)。

3、計算方法

實(shi)際(ji)計算時，檢出限(xian)有2種表示方法：一(yi)(yi)種是(shi)進樣(yang)瓶中樣(yang)品檢測限(xian)，一(yi)(yi)種是(shi)針對(dui)原始樣(yang)品的方法檢出限(xian)。

A、對第一種檢測限(xian)(xian)，只要知道進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)量(liang)和信(xin)噪(zao)比即可計算。如進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)瓶中(zhong)樣(yang)(yang)(yang)品濃(nong)度(du)為(wei)(wei)1 mg/L,在此濃(nong)度(du)下的信(xin)噪(zao)比為(wei)(wei)300(由工作站分析獲得)，則其檢測限(xian)(xian)為(wei)(wei)：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也可用絕對進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)量(liang)表(biao)示，若進(jin)(jin)樣(yang)(yang)(yang)體積為(wei)(wei)10 ul，則其檢測限(xian)(xian)為(wei)(wei)：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表示方(fang)法(fa)，需同時(shi)考慮原始樣品(pin)的(de)取(qu)樣量和(he)提取(qu)樣品(pin)的(de)定(ding)容體(ti)積(ji)。仍按前述樣品(pin)計算，若取(qu)樣量為(wei)(wei)5克，最(zui)后定(ding)容體(ti)積(ji)為(wei)(wei)5 mL，則方(fang)法(fa)檢測限為(wei)(wei)：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原(yuan)始樣品中待檢物質的濃度(du)(du)(du)為0.01mg/kg時，若取樣量為5g,樣品經(jing)前(qian)處理后定(ding)容體積為5mL時,進樣瓶中樣品的濃度(du)(du)(du)可達(da)0.01mg/L（假定(ding)回收率為100%）,此時，在其它給定(ding)的分析條件下(xia)，能產生3倍噪聲強度(du)(du)(du)的信號。在實際檢測工作(zuo)中，第二種表示(shi)方法更為常見。

4、注意事項

由式(shi)（3）可見，信(xin)噪比的(de)(de)大(da)小(xiao)直(zhi)接關(guan)系到檢測限的(de)(de)大(da)小(xiao)。信(xin)噪比計(ji)算(suan)方(fang)法的(de)(de)不(bu)同，其比值大(da)小(xiao)有(you)很大(da)不(bu)同，這與計(ji)算(suan)信(xin)噪比時基(ji)線噪聲峰值的(de)(de)定(ding)義方(fang)式(shi)有(you)關(guan)，一般有(you)三種不(bu)同的(de)(de)定(ding)義：

A、峰(feng)/峰(feng)（peak to peak）信噪比，用某一段基線噪聲的平均高度(du)；

B、峰/半峰（half peak to peak）信(xin)噪比, 用某(mou)一段基(ji)線噪聲平均(jun)高(gao)度(du)的1/2；

C、均方(fang)根（RMS）信噪比，用某一段(duan)基線噪聲的(de)均方(fang)根值計算。

除(chu)此之(zhi)外，信噪(zao)(zao)(zao)比的(de)計算(suan)結(jie)果(guo)還(huan)和所(suo)取噪(zao)(zao)(zao)聲的(de)位置有(you)很大關系，取信號哪一側基(ji)(ji)線(xian)的(de)噪(zao)(zao)(zao)聲，取多長一段基(ji)(ji)線(xian)上的(de)噪(zao)(zao)(zao)聲，計算(suan)結(jie)果(guo)都(dou)很不完全相(xiang)(xiang)同(tong)，有(you)時相(xiang)(xiang)差甚遠。一般多取樣品峰兩側的(de)噪(zao)(zao)(zao)聲峰值計算(suan)。

5、檢出限的確定

A、《全球環境(jing)監測系統(tong)水監測操作指南》中規定：給定置信水平為(wei)95%時，樣(yang)品測定值與零濃度(du)樣(yang)品的測定值有(you)顯著性(xing)差異即為(wei)檢出限：

L = 4.6Sb

式中：L——方(fang)法(fa)的最低檢(jian)出濃度(du)。

Sb ——測(ce)定(ding)(ding)次數為(wei)n次的(de)空白(bai)平行測(ce)定(ding)(ding)（批內）標(biao)準差（重復(fu)測(ce)定(ding)(ding)20次以上）。

B、國際(ji)純粹和(he)應用化學聯合(he)會（IUPAC）規定對各種(zhong)光學分析方法，可(ke)用下(xia)式(shi)計算：

L = KSb/S

L——方法的最低檢出(chu)濃度(du)

Sb——空白多次(ci)測(ce)量(liang)的標準偏差（吸(xi)光(guang)度(du)）；

S ——方法(fa)的(de)靈敏度（即校準曲線(xian)的(de)斜率）

為了(le)評估 ，空白測定次數必(bi)須足夠多，最好能測20次。國際純粹和應用化學聯合會極力(li)提倡取k值為3，一般來說，取 相應的置信水平大約為90%。

若(ruo) =0，并(bing)不(bu)意味著 ，或檢出限(xian)無(wu)限(xian)小。這時需配制一(yi)個濃度略大于零(ling)濃度的(de)試樣系列（能(neng)產生一(yi)個可測信號(hao)值(zhi)）代(dai)替全程序空白試驗，求(qiu)出其(qi)標(biao)準(zhun)偏(pian)差，用(yong)來(lai)代(dai)替 。

此(ci)外，有時為了工作方便和(he)便于(yu)比(bi)較，也規(gui)定(ding)一個大家能接受的信號值作為檢出(chu)(chu)限，如分光光度法中，規(gui)定(ding)吸光度為0.010所對應的濃(nong)度即為檢出(chu)(chu)限L。

C、 美國EPA SW—846規定(ding)方法(fa)中的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分(fen)光光度(du)(du)法(fa)是(shi)以(yi)吸光度(du)(du)（扣除空白）為(wei)(wei)0.010相(xiang)對應的濃(nong)度(du)(du)值或(huo)絕對量為(wei)(wei)檢出限，這是(shi)一種(zhong)實驗室間(jian)的協定方案(an)。

E、氣相色(se)譜法：檢測器恰能產生與噪音(yin)(yin)相區別的響應信號時(shi)所需進(jin)入色(se)譜的物(wu)質最(zui)小(xiao)量(liang)為檢出限，一般為噪音(yin)(yin)的二倍。

F、離(li)子(zi)選擇電極法：當(dang)校準曲線的直(zhi)線部分外延的延長線與通過空(kong)白電位且平行(xing)于濃度軸的直(zhi)線相(xiang)交(jiao)時，其交(jiao)點所對(dui)應的濃度值即為該離(li)子(zi)色(se)譜所對(dui)電極法的檢出限。

由測得的(de)空白值(zhi)(zhi)計算(suan)出的(de)L值(zhi)(zhi)不應大于分析(xi)方法(fa)規(gui)定的(de)最低(di)檢出濃度值(zhi)(zhi)，如大于方法(fa)規(gui)定值(zhi)(zhi)時，必須尋找原(yuan)因降低(di)空白值(zhi)(zhi)，重(zhong)新測定計算(suan)至合格。

6、校(xiao)正曲線繪制(zhi)

A、按分析(xi)方(fang)法步驟，通過實測濃度和儀器信號值的(de)直(zhi)線關(guan)系，確定實驗室條件下的(de)測定上限。當測定上限低(di)于方(fang)法的(de)檢測上限時，只能用(yong)實測的(de)直(zhi)線范(fan)圍。

B、繪制校(xiao)正曲線(xian)的分析步驟應與樣(yang)品(pin)分析相同，并(bing)且不少于5個濃度值。

C、校正(zheng)曲線(xian)(xian)繪(hui)制(zhi)與(yu)(yu)每批(pi)測定樣(yang)品同時(shi)進行，對某(mou)些(xie)分析方(fang)法(fa)的校正(zheng)曲線(xian)(xian)的斜率(lv)穩定，批(pi)間(jian)誤差較小，使用(yong)原制(zhi)校正(zheng)曲線(xian)(xian)時(shi)，應與(yu)(yu)樣(yang)品同時(shi)測定2份中等濃(nong)度(du)標樣(yang)和2份空白的平行樣(yang)。

測(ce)得標準的(de)濃度（減去空白(bai)）值(zhi)與原(yuan)校(xiao)正曲線相(xiang)對(dui)(dui)應(ying)(ying)的(de)濃度值(zhi)的(de)相(xiang)對(dui)(dui)偏差，分(fen)光(guang)光(guang)度應(ying)(ying)小于5%；原(yuan)子吸收法(fa)應(ying)(ying)小于10%，否(fou)則重新制作(zuo)校(xiao)正曲線。

最后還(huan)要(yao)特(te)別(bie)強調，檢出(chu)限(xian)和測(ce)定下限(xian)是兩個(ge)(ge)不同的(de)概(gai)(gai)念(nian)，它們是評(ping)價(jia)一個(ge)(ge)分(fen)(fen)析(xi)(xi)方(fang)法及測試儀器(qi)性(xing)能的(de)重要(yao)(yao)指(zhi)標，檢(jian)(jian)出(chu)限(xian)是一個(ge)(ge)定(ding)性(xing)概(gai)(gai)念(nian)，而(er)測定(ding)下限(xian)是一個(ge)(ge)定(ding)量概(gai)(gai)念(nian)，搞清楚兩者概(gai)(gai)念(nian)和(he)相互關系，可(ke)提高色譜分(fen)(fen)析(xi)(xi)中檢(jian)(jian)測結果的(de)準確性(xing)和(he)可(ke)靠性(xing)，特別在痕量分(fen)(fen)析(xi)(xi)中，檢(jian)(jian)出(chu)限(xian)和(he)測定(ding)下限(xian)的(de)確定(ding)對(dui)于(yu)分(fen)(fen)析(xi)(xi)方(fang)法的(de)選擇具有(you)重要(yao)(yao)意義，同樣的(de)，對(dui)于(yu)實(shi)驗室質(zhi)量控(kong)制也具有(you)很重要(yao)(yao)的(de)意義。

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