編者注：傅若(ruo)農(nong)(nong)教(jiao)授(shou)生(sheng)于1930年(nian)，1953年(nian)畢(bi)業于北京大(da)學(xue)化學(xue)系，而后一(yi)直(zhi)在北京理工(gong)大(da)學(xue)(原北京工(gong)業學(xue)院)從事(shi)(shi)教(jiao)學(xue)與科研工(gong)作。1958年(nian)，傅若(ruo)農(nong)(nong)教(jiao)授(shou)開(kai)始(shi)帶領學(xue)生(sheng)初步進(jin)入(ru)吸(xi)附(fu)柱色(se)譜(pu)和氣相(xiang)色(se)譜(pu)的(de)探索;1966到1976年(nian)文化大(da)革命(ming)的(de)后期(qi)，傅若(ruo)農(nong)(nong)教(jiao)授(shou)在干校(xiao)勞動的(de)間隙，系統(tong)地閱讀(du)并(bing)翻譯了(le)(le)兩本氣相(xiang)色(se)譜(pu)啟(qi)蒙書(shu)，從此(ci)進(jin)入(ru)其后半生(sheng)一(yi)直(zhi)從事(shi)(shi)的(de)事(shi)(shi)業——色(se)譜(pu)研究(jiu)。傅若(ruo)農(nong)(nong)教(jiao)授(shou)是我(wo)國(guo)(guo)老一(yi)輩色(se)譜(pu)研究(jiu)專家(jia)，見(jian)證了(le)(le)我(wo)國(guo)(guo)氣相(xiang)色(se)譜(pu)研究(jiu)的(de)發展，為(wei)我(wo)國(guo)(guo)培(pei)養(yang)了(le)(le)眾多色(se)譜(pu)研究(jiu)人才。

 

第(di)一講：傅若農講述氣相色譜技(ji)術(shu)發展歷史及趨(qu)勢

第二講(jiang)：傅若農：從三(san)家(jia)公司GC產品更迭看氣相技術發(fa)展

第三講(jiang)：傅若農(nong)：從(cong)國產氣(qi)相產品(pin)看國內氣(qi)相發(fa)展脈絡及現狀(zhuang)

第四講：傅若農：氣相(xiang)色譜(pu)固定液的(de)前世今生

第五講：傅(fu)若農：氣-固(gu)色(se)譜的(de)魅力

第(di)六(liu)講(jiang)：傅若農：PLOT氣相色(se)譜柱(zhu)的誘惑力

第七講：傅若農：酒駕判官—頂空氣相色譜的前(qian)世(shi)今生(sheng)

第八講：傅若農：一掃(sao)而光——吹掃(sao)捕(bu)集-氣相色譜(pu)的發展

第九講：傅(fu)若農：凌(ling)空一(yi)瞥洞(dong)察一(yi)切——神通廣大的固相微萃取（SPME）

第十講：傅若農：扭轉乾坤—神奇的反應頂空氣相色譜分析

前言

　　脂質(zhi)是一(yi)類自(zi)然界(jie)存(cun)在(zai)的(de)(de)疏水(shui)或兩性、難溶于(yu)(yu)(yu)水(shui)而易溶于(yu)(yu)(yu)非極性溶劑的(de)(de)有機(ji)物(wu)(wu)小分(fen)子(zi)，存(cun)在(zai)于(yu)(yu)(yu)大多數生物(wu)(wu)體系(xi)中。脂質(zhi)是細(xi)胞膜的(de)(de)骨架(jia)物(wu)(wu)質(zhi)和第二能(neng)量來源，還(huan)參(can)與(yu)細(xi)胞的(de)(de)許(xu)多重要(yao)功(gong)能(neng)，人類許(xu)多重大疾病(bing)都與(yu)脂質(zhi)代(dai)謝(xie)紊亂有關，如糖(tang)尿(niao)病(bing)、肥胖病(bing)、癌(ai)癥(zheng)、阿茲海默癥(zheng)、以及一(yi)些(xie)傳染病(bing)等，

　　作為代(dai)謝(xie)組學的(de)(de)重要分支之(zhi)一(yi)，脂(zhi)質組學(Lipidomics)的(de)(de)研究(jiu)對(dui)象是(shi)生(sheng)(sheng)物體的(de)(de)所有脂(zhi)質分子，并以(yi)此為依據推測其(qi)它與脂(zhi)質作用的(de)(de)生(sheng)(sheng)物分子的(de)(de)變化，進而揭示(shi)脂(zhi)質在各種生(sheng)(sheng)命活動中(zhong)的(de)(de)重要作用機制。脂(zhi)質組學是(shi)總體研究(jiu)和這些疾病有關的(de)(de)脂(zhi)質化合(he)物，找到昭(zhao)示(shi)這些疾病的(de)(de)生(sheng)(sheng)物標記物。

　　2005年國際(ji)上把組織、細胞中的(de)脂質分子分為8大類(lei)(J Lipid Res 2009,50(Supp);9-14)，有(you)(you)明確結(jie)構(gou)的(de)脂質化合物(wu)已經有(you)(you)38000個(ge)(BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 7):S9)，這(zhe)8類(lei)脂質分子見表(biao)1。

表 1 8大類脂質分子

類別	縮寫	數(shu)據庫中的結構數(shu)量(liang)
脂肪酰類(Fatty acyls)	FA	2678
甘油脂(zhi)類(glycerolipids )	GL	3009
甘油磷(lin)酸脂類(glycerophospholipids)	GP	1970
鞘脂類(sphingolipids )	SP	620
固醇脂類(sterol lipids )	ST	1744
異戊烯醇(chun)脂類(prenol lipids ()	PR	610
糖脂類(saccharolipids )	SL	11
多聚乙烯類(polyketides )	PK	132

　　在過去，由于(yu)技術限制人們難以分(fen)析(xi)(xi)數量巨大的(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)析(xi)(xi)，因(yin)為多種脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)代謝產物(wu)的(de)(de)物(wu)理性質(zhi)(zhi)(zhi)需要大批純(chun)化系統、分(fen)離的(de)(de)復雜(za)技術操作。2003年(nian)韓賢林等繼基(ji)因(yin)組(zu)學(xue)、蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)組(zu)學(xue)等之后提出脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)組(zu)學(xue)(lipidomics)(Han X et a1.J Lipid Res，2003，44：1071)，脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)組(zu)學(xue)的(de)(de)發展推動了新分(fen)析(xi)(xi)平臺的(de)(de)研發，特別是(shi)在質(zhi)(zhi)(zhi)譜法(fa)領域(yu)，該(gai)方法(fa)已(yi)使這些操作合理化，并且已(yi)允許更多的(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)子得到非常詳(xiang)細的(de)(de)分(fen)析(xi)(xi)。

　　脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)存(cun)在于細(xi)胞、細(xi)胞器和(he)(he)細(xi)胞外的(de)(de)(de)(de)(de)體液(ye)如血漿、膽汁、乳、腸液(ye)、尿(niao)液(ye)中(zhong)(zhong)。若要研究某(mou)一特定部(bu)位的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，首先要將(jiang)這部(bu)分組(zu)織或細(xi)胞分離(li)(li)出來。由(you)于脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)不溶于水(shui)，通常(chang)采用(yong)有(you)機(ji)溶劑進行(xing)萃(cui)取(qu)(qu)(qu)。傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)(de)萃(cui)取(qu)(qu)(qu)劑是氯(lv)仿、甲(jia)醇和(he)(he)水(shui)的(de)(de)(de)(de)(de)混合(he)(he)液(ye)。所需(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品在這種(zhong)混合(he)(he)液(ye)中(zhong)(zhong)提取(qu)(qu)(qu)所有(you)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，向提取(qu)(qu)(qu)液(ye)中(zhong)(zhong)加入過量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)使之(zhi)分成2個相(xiang)，上面(mian)是甲(jia)醇和(he)(he)水(shui)，下面(mian)是氯(lv)仿。脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)就(jiu)留在氯(lv)仿相(xiang)，蒸發濃縮后(hou)，使之(zhi)干燥就(jiu)得到所需(xu)(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)。這種(zhong)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)提取(qu)(qu)(qu)方(fang)法(fa)(fa)，能夠提出組(zu)織樣(yang)(yang)(yang)(yang)品中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)脂(zhi)(zhi)。這種(zhong)方(fang)法(fa)(fa)降低了脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)損失率，操(cao)作簡便(bian)，而且提取(qu)(qu)(qu)效果較好。對于只檢測(ce)總(zong)脂(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)部(bu)分脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，固(gu)相(xiang)萃(cui)取(qu)(qu)(qu)(SPE)是一種(zhong)較好的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)，利用(yong)固(gu)體吸附(fu)劑將(jiang)液(ye)體樣(yang)(yang)(yang)(yang)品中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)目標(biao)化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)物(wu)吸附(fu)，與樣(yang)(yang)(yang)(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)基體和(he)(he)干擾物(wu)分離(li)(li)，然(ran)后(hou)再(zai)用(yong)洗(xi)脫液(ye)洗(xi)脫或加熱解(jie)吸附(fu)，達到分離(li)(li)和(he)(he)富集目標(biao)化(hua)(hua)(hua)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)(de)。固(gu)相(xiang)萃(cui)取(qu)(qu)(qu)技(ji)術設(she)備(bei)要求低，操(cao)作簡單，能快速分離(li)(li)組(zu)分復雜及含量(liang)低的(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品。當然(ran)由(you)于化(hua)(hua)(hua)學分析樣(yang)(yang)(yang)(yang)品前(qian)處(chu)(chu)理(li)技(ji)術的(de)(de)(de)(de)(de)發展，有(you)許多其他可用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)(yang)品前(qian)處(chu)(chu)理(li)方(fang)法(fa)(fa)。

　　總體上(shang)對脂質組學的(de)研(yan)究Chin Chye Teo等歸(gui)納(na)為如下的(de)工作流程(cheng)，第一(yi)步就是對樣(yang)品的(de)處理(li)。

1、脂質組學研究的工作流程

　　根據Chin Chye Teo的綜述報告(gao)(Chin Chye Teo et al,TrAC,2015,65:1-18)，脂(zhi)質組學研究的工作(zuo)流程如下表1.

表1 脂質組學研究的工作流程

從患者得到脂質(zhi)組學研究的樣品
液體	固體
體液，淚(lei)水(shui)，血清，血漿，尿液 （低溫保(bao)存樣品）	細胞，組織，器官
對上述樣品進行萃取方法
對極性化合(he)物，單獨的(de)有機化合(he)物進行： 液(ye)-液(ye)萃取(qu)，固(gu)相萃取(qu)	對能源(yuan)性物質(zhi)進行：加壓液相萃(cui)(cui)取，微波輔助(zhu)萃(cui)(cui)取，超聲輔助(zhu)萃(cui)(cui)取
萃取得(de)到(dao)的(de)脂質化合物
使(shi)用色譜方法分離：氣(qi)相色譜，液相色譜，電(dian)泳(yong)	不使用(yong)色譜方(fang)法分離：直接進(jin)樣，成像(xiang)
上述分離或未分離樣品進行質譜分析
質譜分析的(de)接(jie)口	質量分析器(qi)
電(dian)(dian)子轟擊電(dian)(dian)離(li)（EI），電(dian)(dian)噴霧電(dian)(dian)離(li)（ESI），化學電(dian)(dian)離(li)（CI），大氣壓（APCI）化學與電(dian)(dian)離(li),基質輔助激光(guang)解析(xi)電(dian)(dian)離(li)（MALDI）	 四(si)級桿(gan)飛行時間(jian)質(zhi)譜（qTOF）,三重四(si)級桿(gan)質(zhi)譜（ qqq）,軌道阱質(zhi)譜（Orbitrap）
質譜原始數據語預處理 （利用商品(pin)或(huo)自制軟件）
分類和脂(zhi)質鑒定（使用各(ge)種資源如LIPID maps,Lipid Bank,Lipid Blast）
判定在疾病中的機制/在疾病演化中的作用
為進一步診斷找出生物(wu)標記(ji)物(wu)（預(yu)防），提供藥物(wu)治療的指導(dao)

2、脂質組學的樣品制備

　　本文只講脂質(zhi)組學的(de)樣品制備，Chin Chye Teo等(deng)總結了(le)近年在脂質(zhi)組學研(yan)究中使用的(de)樣品處理方法，見表2.

表2 脂質組學研究中的樣品處理方法比較(Chin Chye Teo et al,TrAC,2015,65:1-18) 

萃取方(fang)法	臨床樣品類型(xing) （生(sheng)物(wu)液(ye)體或固體）	優點	缺點	原(yuan)文(wen)文(wen)獻編號
單一有(you)機溶(rong)劑萃(cui)取（SOSE）	血清（生物液體）   皮膚（固體）	容易完成 萃取時間短(duan) 成本低 低溫適于熱敏感化(hua)合物 無需外部能(neng)量	使用有(you)毒有(you)機溶劑 分析時難以擺脫使用(yong)有機溶劑(ji)	1.2   3
液(ye)(ye)-液(ye)(ye)萃取（LLE）	眼淚(lei)（生物液體） 血清（生(sheng)物(wu)液體） 血漿（生(sheng)物液體） 尿液（生物(wu)液體） 滑液(ye)（生物液(ye)體(ti)） 動脈粥樣硬化血小(xiao)板（生物(wu)液體(ti)） 皮膚（固體） 組織（固(gu)體(ti)）	易于建立(li)的方法 容易完成 設(she)備便宜 萃(cui)取時間短(duan) 使用廉價溶劑（如(ru)甲醇，水） 低溫(wen)適(shi)于(yu)熱敏感化(hua)合物(wu) 無需外部能量 萃取時間(jian)短	使用大量有毒有機溶劑 常使(shi)用(yong)超過一種類型的溶劑(ji) 需要排(pai)除溶劑以免影響分析(xi)	2 4,9-13 5,14-22 8,23 7 24   25-27 28,29
固相萃取（SPE）	血清(qing)（生物液體） 血清（生物液體） 血漿（生物液(ye)體） 眼（固(gu)體） 皮(pi)膚(fu)（固(gu)體(ti)）	容易完成 清除(chu)干擾基體 EPE的選(xuan)擇 低溫適(shi)于熱(re)敏(min)感化合物(wu) 萃(cui)取時(shi)間短	SPE萃取小柱比較(jiao)貴(gui) 需要洗掉有(you)機溶劑以免影響分析 使用有毒有機溶(rong)劑 分析時難以(yi)擺脫使用有機(ji)溶(rong)劑	1,12 2 30 26 3,27
固相微萃(cui)取（SPME）	肺(fei)（固體） 頭發（固體）	容(rong)易完成 可(ke)與GC和GC xGC 聯用 對揮發性(xing)化合物可(ke)以進行頂空氣相色譜 有毒溶劑消耗量少 低溫(wen)適(shi)于(yu)熱敏感(gan)化合物 無(wu)需外部(bu)能量 萃取時間(jian)短	萃(cui)取(qu)頭比較貴(gui) 需要洗掉有機溶劑以免影響分析(xi) 分析(xi)時(shi)難以擺脫使用有機溶(rong)劑	31 32
超臨界(jie)流體萃(cui)取（SFE）	血漿(jiang)（生物液(ye)體）	容易完成 萃(cui)取(qu)時(shi)間(jian)短 對非極性化合物萃取效率高 CO2可循環使用 溫(wen)度壓(ya)力可(ke)控 可加改性(xing)劑提高(gao)萃取液(ye)極性(xing)和效率	要精心操(cao)作 設(she)備(bei)昂(ang)貴	33
微波輔助萃取（MAE）	血漿（生物液體） 皮膚（固體）	容(rong)易完成 萃取時間短 萃取效(xiao)率(lv)高 萃(cui)取溶(rong)劑消(xiao)耗量少 溫度壓力可(ke)控	需要冷卻防止溶(rong)劑逃逸 購買設備費用高	34   35
超聲輔助萃取（UAE）	血（生物液體）	容易完成 萃取時間短 萃取溶劑消耗量少(shao) 溫度(du)壓(ya)力可控	聽力(li)會(hui)受損 要使用有毒(du)有機溶(rong)劑 會吸入有害溶劑 需要(yao)外部能(neng)源 購買(mai)設備費用高 提高溫(wen)度會使化合物降解	36,37

3、脂質組學的溶劑萃取

　　液(ye)-液(ye)萃(cui)(cui)取是(shi)脂質組學研究中使用(yong)最為(wei)普遍(bian)的方(fang)法(fa)，這一方(fang)法(fa)是(shi)使用(yong)兩種(zhong)互不(bu)混溶的有機(ji)溶劑——使用(yong)最多(duo)的是(shi)氯(lv)(lv)(lv)仿(fang)、甲(jia)醇(chun)和水(shui)(shui)——為(wei)了對關鍵脂質類得(de)到最大的萃(cui)(cui)取效率，從(cong)磷脂類和糖脂類到脂肪酸(suan)，三酰(xian)基(ji)甘油(you)(you)類(TAGs)、二酰(xian)基(ji)甘油(you)(you)類(DAGs)。最初使用(yong)的是(shi)Folch 脂質萃(cui)(cui)取法(fa)(氯(lv)(lv)(lv)仿(fang)/甲(jia)醇(chun)/水(shui)(shui)為(wei) 8:4:3 v/v/v)，之(zhi)后有Bligh 和 Dyer脂質萃(cui)(cui)取法(fa)(氯(lv)(lv)(lv)仿(fang)/甲(jia)醇(chun)/水(shui)(shui)為(wei) 1:2:0.8 v/v/v)。

　　(1)Folch 脂(zhi)質萃(cui)取(qu)法(Folch et al., J Biol Chem 1957, 226： 497)

　　把(ba)樣品(pin)組織(zhi)用(yong)2:1氯仿/甲(jia)醇(chun)均一化，最后(hou)的溶劑體(ti)積是組織(zhi)的20倍(20mL 溶劑里有1g樣品(pin))，分散均勻(yun)(yun)后(hou)于室(shi)溫下把(ba)混合物(wu)在軌(gui)道(dao)振蕩器上震動15-20min。均勻(yun)(yun)混合物(wu)經(jing)漏斗(dou)中折疊濾紙(zhi)過濾，或進行離心(xin)處理，回收(shou)液(ye)相。

　　液相(xiang)溶劑用(yong)0.2體積的水(shui)(20 mL液相(xiang)使用(yong)4 mL水(shui))，最好使用(yong)0.9%的NaCl溶液洗(xi)滌(di)，渦旋幾秒后(hou)在低速離心(xin)機(ji)(ji)(2000 rpm)上離心(xin)混(hun)合物(wu)，用(yong)虹(hong)吸(xi)方法棄去上層液相(xiang)，用(yong)以分析神經節糖苷或小分子有機(ji)(ji)極性化(hua)合物(wu)，如需(xu)要(需(xu)移(yi)去標記(ji)分子)，用(yong)1:1甲(jia)醇/水(shui)洗(xi)滌(di)交界處的有機(ji)(ji)相(xiang)兩次(ci)，無需(xu)混(hun)合全部制備(bei)物(wu)。

　　經離(li)心分離(li)后(hou)虹吸掉上面的(de)液相(xiang)，下面含(han)有脂(zhi)質(zhi)的(de)氯仿在(zai)旋轉(zhuan)蒸(zheng)發器中真空蒸(zheng)發，或(huo)用(yong)氮氣吹(chui)拂(fu)到2-3 mL體積(ji)。

　　(2)Bligh 和 Dyer脂質萃(cui)取法(Can J Biochem Physiol 37:911-917)

　　a. 每1 mL 樣(yang)品(pin)加入3.75mL 1:2(v/v) CHCl3:CH3OH 很(hen)好渦旋(xuan)，如果(guo)要進行GC 分析，溶劑中要含有內標(biao)(如0.5μg谷甾(zai)醇)

　　b. 然(ran)后加入1.5mL CHCl3很(hen)好(hao)渦旋

　　c. 最后(hou)加入1.25mL蒸餾水很好(hao)渦(wo)旋

　　d. 在1000rpm離心(xin)機(ji)中室溫下離心(xin)5min，得到(dao)一個兩相分離(上層為水相，下層為有機(ji)相)的液體

　　e. 回收有機相(xiang)：用一個巴斯德吸(xi)管(guan)(Pastuer pipette)通過上層(ceng)水相(xiang)，輕微施加正壓避免上層(ceng)水相(xiang)浸入吸(xi)管(guan)，吸(xi)管(guan)口到(dao)(dao)達(da)離心管(guan)底部，吸(xi)取下層(ceng)有機相(xiang)溶(rong)液的90%到(dao)(dao)吸(xi)管(guan)中。

下表列出不同樣品容積需要加入的試劑量

　　如果你要得(de)到干(gan)凈的(de)底部的(de)有(you)機相(xiang)(xiang)溶(rong)液(ye)，就要用上層“真正”的(de)上層液(ye)相(xiang)(xiang)洗滌(di)有(you)機相(xiang)(xiang)溶(rong)液(ye)，方法如下(xia)：

　　a 制(zhi)備(bei)“真正”的上層液相(xiang)：取一(yi)個大的玻(bo)璃管(guan)(guan)，或者幾個常規玻(bo)璃管(guan)(guan)，以水代(dai)替樣(yang)品胺上述方法進行萃取操(cao)作，把幾個管(guan)(guan)子(zi)中的上層水相(xiang)合(he)并在一(yi)起備(bei)用。

　　b 把上述第(di)5步得(de)到(dao)的底層(ceng)溶液(ye)倒(dao)入一(yi)個玻璃管中，然后加入適(shi)量(樣(yang)品+蒸餾水的體積)“真正”的上層(ceng)液(ye)相(xiang)。比如你是1 mL樣(yang)品就加入2.25mL“真正”的上層(ceng)液(ye)相(xiang)。

　　c 好好地(di)渦旋，離心，收集下層相。

　　Cui等(deng)的(de)改進Bligh 和(he) Dyer脂質萃取法(Cui L，e al, PLoS Negl Trop Dis，2013，7：e2373)：

　　900µL氯仿-甲醇(1:2)加入到100 µL樣品中，進行渦旋，在4°C下保(bao)溫，然(ran)后加入300µL氯仿和300µL雙重(zhong)蒸餾水，以(yi)9000 rpm離心(xin)2 min，脂(zhi)質(zhi)物(wu)在離心(xin)管(guan)底(di)部的有(you)機(ji)相(xiang)中，然(ran)后加入500 µL氯仿在4°C下進行渦旋20 min。從有(you)機(ji)相(xiang)中回收(shou)脂(zhi)質(zhi)物(wu)并與前(qian)次得到的脂(zhi)質(zhi)物(wu)合并，脂(zhi)質(zhi)萃取物(wu)經真空干燥后于−80°C下存放備用。

　　多少(shao)年來(lai)人們(men)使(shi)用類似于上(shang)述方法(fa)(fa)(fa)進(jin)行(xing)脂質的(de)萃(cui)取，例如：李(li)國琛等(deng)在脂質組學研究中也采用Bligh 和 Oyer法(fa)(fa)(fa)萃(cui)取磷脂，并作適當改(gai)進(jin).他們(men)的(de)方法(fa)(fa)(fa)是：

　　稱取(qu)(qu)100 mg魚肉(rou)樣品(pin)，加(jia)入(ru)400 p,L甲醇/氯仿(fang)(體(ti)積比(bi)2：1)，渦旋混勻后(hou)，于一(yi)30℃放置過夜.取(qu)(qu)出后(hou)于4℃以10000 轉速離心5 min.將(jiang)上清(qing)(qing)液(ye)轉出，在殘渣中加(jia)入(ru)200 mL甲醇/氯仿(fang)(體(ti)積比(bi)2：1)再次提取(qu)(qu)，將(jiang)2次所得上清(qing)(qing)液(ye)合并(bing).在上清(qing)(qing)液(ye)中先后(hou)加(jia)入(ru)100 mL氯仿(fang)及100mL水，離心后(hou)，將(jiang)磷脂所在的(de)氯仿(fang)相與水相分(fen)離.采(cai)用真空離心蒸發(fa)濃縮器干燥氯仿(fang)相(溫度不超過45℃，下同)，將(jiang)干燥后(hou)的(de)樣品(pin)于一(yi)30℃保存(cun)備(bei)用.(高等學校化學學報，2010,31(2)：269-273)

　　人們為了提高某些(xie)(xie)脂(zhi)質種(zhong)類的(de)(de)萃(cui)取(qu)效率，改變氯仿(fang)/甲醇/水的(de)(de)比例，并加入一些(xie)(xie)其他(ta)添加劑，如(ru)乙酸(suan)、鹽(yan)酸(suan)等，探索改進(jin)萃(cui)取(qu)各類脂(zhi)質化合物的(de)(de)得率，如(ru)酸(suan)性(xing)磷脂(zhi)和脂(zhi)肪酸(suan)。(Jensen S K, Lipid Technol，2008， 20： 280–281)。

HCl-Bligh萃取法步驟：

　　為了更好地萃取(qu)生(sheng)物(wu)(wu)樣品中(zhong)的脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸，使(shi)用加(jia)(jia)鹽(yan)酸的HCl-Bligh萃取(qu)法(fa)：取(qu)0.6 g均(jun)勻好的樣品裝入10-ml 帶蓋的培養試(shi)管中(zhong)，加(jia)(jia)如1 ml 3M HCl，在(zai)80℃水浴上加(jia)(jia)熱1 h，之(zhi)后加(jia)(jia)入1.50 ml甲醇(chun)(chun)和1.00 ml氯仿(fang)，以及17:0脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸內(nei)標，把(ba)混(hun)合物(wu)(wu)搖震1 min，然(ran)(ran)后加(jia)(jia)入ELGA-純水系統(tong)制備的純水1.00 ml 和2.00 ml氯仿(fang)，把(ba)試(shi)管振蕩1 min，然(ran)(ran)后在(zai)3000 rpm離(li)心(xin)(xin)機(ji)上進(jin)行(xing)離(li)心(xin)(xin)處理5 min。把(ba)1 ml氯仿(fang)相進(jin)行(xing)甲基(ji)化(hua)，用氮氣把(ba)氯仿(fang)蒸發掉，加(jia)(jia)入0.8 ml NaOH/甲醇(chun)(chun)溶液(ye)，把(ba)試(shi)管充滿氮氣，密(mi)封在(zai)100 ℃下(xia)烘箱中(zhong)15 min，冷卻后加(jia)(jia)入1 ml BF3溶液(ye)，密(mi)封在(zai)100 ℃下(xia)烘箱中(zhong)45 min。在(zai)冷卻后加(jia)(jia)入2 ml辛烷(wan)和4 ml飽(bao)和NaCl溶液(ye)，把(ba)混(hun)合物(wu)(wu)進(jin)行(xing)渦(wo)旋(xuan)，在(zai)3000 rpm離(li)心(xin)(xin)機(ji)上進(jin)行(xing)離(li)心(xin)(xin)處理10 min。用1μL 樣品進(jin)行(xing)氣相色譜分(fen)析。

　　根據Jensen的(de)研究(jiu)，認為此(ci)方法可(ke)以對(dui)脂肪(fang)酸(suan)的(de)萃(cui)取率提(ti)高15%，對(dui)多不飽和脂肪(fang)酸(suan)的(de)萃(cui)取率可(ke)提(ti)高30-50%。

　　由于氯仿(fang)的(de)毒性大人們就(jiu)用二氯甲(jia)烷(wan)來代替氯仿(fang)(J Agr Food Chem,2008,56:4297-4303)，之后就(jiu)有許多研究(jiu)者效仿(fang)用以(yi)萃(cui)取臨床樣品，包括生物液體，如(ru)血(xue)清(qing)/血(xue)漿，尿液和(he)固體樣品，如(ru)皮膚和(he)動(dong)脈粥(zhou)樣硬化血(xue)小板(表中文獻4,5,8,9,10,14-17,23-25,28).

　　近幾年(nian)也用(yong)甲基特丁基醚(MTBM )做萃(cui)取(qu)溶(rong)劑(ji)代替氯仿(Matyash et al. J Lipid Res. 2008，49 (5) ：1137–1146.)。Matyash 認為MTBM進(jin)(jin)行(xing)萃(cui)取(qu)快速而且可(ke)以(yi)得到干凈的(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)，可(ke)以(yi)適合于自動(dong)進(jin)(jin)行(xing)鳥(niao)槍法得到脂(zhi)(zhi)質(zhi)輪(lun)廓(kuo)。因為MTBM的(de)(de)密度低，水相(xiang)和有機(ji)(ji)相(xiang)分(fen)開(kai)時，有機(ji)(ji)相(xiang)在上層，這樣簡化了(le)手(shou)機(ji)(ji)有機(ji)(ji)相(xiang)的(de)(de)手(shou)續，減少了(le)吸取(qu)的(de)(de)損失，不可(ke)萃(cui)取(qu)的(de)(de)基質(zhi)小球(qiu)處于離心管(guan)的(de)(de)底(di)部，易于去除。嚴格(ge)的(de)(de)測試證明MTBM進(jin)(jin)行(xing)萃(cui)取(qu)對絕大多數脂(zhi)(zhi)質(zhi)種類和“黃金標(biao)準”Folch 或(huo) Bligh and Dyer萃(cui)取(qu)方法類似或(huo)更好。2013年(nian)中(zhong)科院大連(lian)化學物理研(yan)究(jiu)所(suo)許國旺和德國圖賓根大學醫學院的(de)(de)R Lehmannb使用(yong)MTBM進(jin)(jin)行(xing)萃(cui)取(qu)開(kai)創了(le)一(yi)個從一(yi)小片肝臟或(huo)肌肉(rou)組(zu)織同時進(jin)(jin)行(xing)道謝組(zu)學和脂(zhi)(zhi)質(zhi)組(zu)學的(de)(de)研(yan)究(jiu)(J Chromatog A, 2013， 1298：9– 16)

　　人們的(de)思路總是由簡單(dan)到復雜(za)，又(you)由復雜(za)回歸到簡單(dan)，所(suo)以脂(zhi)(zhi)質(zhi)組學中的(de)萃取(qu)方法(fa)，近(jin)來也(ye)有多種溶劑(ji)向單(dan)一溶劑(ji)發展， Stübiger G (表中文獻1)就(jiu)使用 Zhao Z等提出的(de)單(dan)一溶劑(ji)萃取(qu)(SOSE)磷脂(zhi)(zhi)類脂(zhi)(zhi)質(zhi)(J Lipid Res 2010;51:652)方法(fa)如下(xia)：

　　把500 mL甲醇加入到(dao)(dao)20 mL人血漿中(zhong)，其中(zhong)已經(jing)含有(you)0.01% BHT(2,6-二叔丁基對甲酚)和0.5 mmol EDTA (用作抗(kang)氧化(hua)劑)和3mmol Pefablock(4-(2 aminoethyl) benzenesulfonylfluoride hydrochloride)用作磷脂酶的抑制劑，加入內標(biao)物，把樣品激烈震蕩1min，在冰浴中(zhong)放置30 min，進行脂質(zhi)的萃取，之后在10,000 rpm離心(xin)機上，離心(xin)5 min(4℃)，最后把離心(xin)管上面的液體(ti)小心(xin)滴轉(zhuan)移到(dao)(dao)2 mL玻璃樣品瓶中(zhong)，在零(ling)下70℃保存(cun)備(bei)用。

4、固相萃取(SPE)

　　SPE 是十(shi)分(fen)(fen)(fen)成熟的(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)預處(chu)理技術，使用裝有(you)(you)固(gu)定(ding)相(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)小(xiao)柱(zhu)子(zi)和(he)各(ge)種(zhong)(zhong)流動相(xiang)(xiang)選(xuan)擇(ze)性(xing)地(di)保留與固(gu)定(ding)相(xiang)(xiang)有(you)(you)特定(ding)作用力的(de)(de)(de)特殊(shu)種(zhong)(zhong)類分(fen)(fen)(fen)子(zi)。SPE的(de)(de)(de)典型應用是和(he) SOSE 和(he) LLE相(xiang)(xiang)結合(he)，作為一種(zhong)(zhong)附加的(de)(de)(de)凈化步驟或從(cong)生物液體或固(gu)體住(zhu)址樣(yang)品(pin)中(zhong)富集某(mou)種(zhong)(zhong)特定(ding)種(zhong)(zhong)類的(de)(de)(de)目標脂(zhi)質(zhi)(表(biao)中(zhong)文獻1,3,12,26,27)，市場有(you)(you)各(ge)種(zhong)(zhong)各(ge)樣(yang)的(de)(de)(de)萃取小(xiao)柱(zhu)供選(xuan)擇(ze)。供脂(zhi)質(zhi)萃取的(de)(de)(de)SPE小(xiao)柱(zhu)有(you)(you)正(zheng)相(xiang)(xiang)硅(gui)膠柱(zhu)和(he)反相(xiang)(xiang)柱(zhu)(C8 和(he) C18)，以及離(li)子(zi)交換(huan)柱(zhu)(氨(an)丙基(ji)(ji)柱(zhu))，硅(gui)膠柱(zhu)和(he)氨(an)丙基(ji)(ji)柱(zhu)多用于(yu)(yu)分(fen)(fen)(fen)離(li)中(zhong)性(xing)和(he)極性(xing)脂(zhi)質(zhi)，利用改變洗脫溶(rong)劑以達到分(fen)(fen)(fen)離(li)的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)。而C8 和(he) C18柱(zhu)用于(yu)(yu)從(cong)水基(ji)(ji)樣(yang)品(pin)中(zhong)分(fen)(fen)(fen)離(li)卵(luan)磷(lin)脂(zhi)(PC)、腦苷(gan)脂(zhi)、神經節糖苷(gan)和(he)脂(zhi)肪酸。

　　針對不同(tong)的脂(zhi)(zhi)質使用不同(tong)的SPE，如(ru) Stübiger(表2文獻(xian)1)在(zai)進行(xing)導致動脈粥樣硬化的磷脂(zhi)(zhi)的研究中，使用C18 凈化柱(zhu)從血漿脂(zhi)(zhi)質萃(cui)取(qu)和富集體(ti)液(ye)氧化磷脂(zhi)(zhi)(OxPLs)，其步驟如(ru)下：

　　把脂(zhi)(zhi)質(zhi)萃取(qu)液倒入微量(liang)制備高效固相萃取(qu)柱(zhu)(mHP-SPE)C18 spin-columns (PepClean, Pierce)中(zhong)，小(xiao)柱(zhu)事先用(yong)500mL MeOH：0.2%甲酸(70:30 重量(liang)比(bi))洗(xi)滌，然(ran)后用(yong)700 mL MeOH:0.2%甲酸(82:18 重量(liang)比(bi))洗(xi)脫一次，再(zai)用(yong)800 mL MeOH:0.2%甲酸(92:2 重量(liang)比(bi))洗(xi)脫一次，最后小(xiao)柱(zhu)用(yong)500 mL 2-丙醇再(zai)生(sheng)，以便從(cong)小(xiao)柱(zhu)中(zhong)徹底(di)清除(chu)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(即中(zhong)性脂(zhi)(zhi)質(zhi))，凈化后的純度用(yong)薄層(ceng)色譜檢查(cha)，得(de)到(dao)的氧(yang)化脂(zhi)(zhi)質(zhi)用(yong)LC-ESI-MS/MS進行分析。

　　而Ruben t’Kindt進(jin)行(xing)皮膚神經酰胺的脂質(zhi)組學研究中(zhong)，則(ze)使用氨丙基硅膠小柱對脂質(zhi)萃取液進(jin)行(xing)凈化(表(biao)2文獻(xian)3)，方法如(ru)下：

　　使用(yong)(yong)氨丙(bing)基(ji)硅膠(jiao)小柱(100 mg, 3.0 mL)先(xian)用(yong)(yong)2 mL己(ji)烷(wan)洗滌，把(ba)已經干(gan)燥的脂質溶于300 μL 11:1 的己(ji)烷(wan)：異(yi)(yi)丙(bing)醇(chun)(chun)(v/v)中(zhong)，用(yong)(yong)2 mL己(ji)烷(wan)/甲(jia)醇(chun)(chun)/氯(lv)(lv)仿(fang)(fang)(80/10/10 (v/v))洗脫神經酰胺，用(yong)(yong)氮氣吹掃干(gan)燥，溶于300 μL異(yi)(yi)丙(bing)醇(chun)(chun)/氯(lv)(lv)仿(fang)(fang)(50/50)(v/v)中(zhong)，進行HPLC/MS分析。

5、固相微萃取(SPME)

　　Pawliszyn 研究組在1991年發(fa)明了(le)SPME，1993年出現(xian)了(le)SPME的(de)(de)(de)商品(pin)化產品(pin)，使(shi)(shi)之成為(wei)廣泛(fan)使(shi)(shi)用(yong)的(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)前處(chu)理(li)(li)技術(shu)。這(zhe)(zhe)一方(fang)法是(shi)集萃(cui)取(qu)(qu)、濃縮(suo)、解吸(xi)、進(jin)(jin)樣(yang)于(yu)一體，它以(yi)(yi)(yi)固(gu)相(xiang)(xiang)(xiang)萃(cui)取(qu)(qu)(SPE)為(wei)基礎，保留(liu)了(le)SPE的(de)(de)(de)全(quan)部優(you)點，排除了(le)需要柱填充物和使(shi)(shi)用(yong)有機溶劑進(jin)(jin)行解吸(xi)的(de)(de)(de)缺(que)點。SPME是(shi)以(yi)(yi)(yi)涂(tu)漬(zi)在石英(ying)玻璃纖維上(shang)的(de)(de)(de)固(gu)定(ding)相(xiang)(xiang)(xiang)(高分(fen)子(zi)(zi)涂(tu)層(ceng)或吸(xi)著劑)作為(wei)吸(xi)收(shou)(吸(xi)附)介質(zhi)，對目標分(fen)析(xi)物進(jin)(jin)行萃(cui)取(qu)(qu)和濃縮(suo)，并(bing)在氣(qi)相(xiang)(xiang)(xiang)色譜進(jin)(jin)樣(yang)口中(zhong)直(zhi)接熱解吸(xi)(或用(yong)HPLC流動相(xiang)(xiang)(xiang)沖洗到液相(xiang)(xiang)(xiang)色譜柱中(zhong)，甚至可以(yi)(yi)(yi)直(zhi)接進(jin)(jin)行質(zhi)譜分(fen)析(xi))，這(zhe)(zhe)一技術(shu)適合于(yu)揮發(fa)性(xing)和半揮發(fa)性(xing)有機物的(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)處(chu)理(li)(li)和分(fen)析(xi)。SPME有8大(da)優(you)點：1 操作簡單，2 功能多樣(yang)，3 設(she)備低廉(lian)，4 萃(cui)取(qu)(qu)快捷，5 無(wu)需溶劑，6 可在線、活(huo)體取(qu)(qu)樣(yang)，7 可自動化， 8 可在分(fen)析(xi)系統直(zhi)接脫(tuo)附。SPME可以(yi)(yi)(yi)對環境中(zhong)的(de)(de)(de)污染物進(jin)(jin)行檢(jian)測，如(ru)：農(nong)藥殘(can)留(liu)、酚類、多氯聯苯、多環芳烴、脂肪酸、胺類、醛類、苯系物、非(fei)離(li)子(zi)(zi)表(biao)面(mian)活(huo)性(xing)劑以(yi)(yi)(yi)及有機金屬(shu)化合物、無(wu)機金屬(shu)離(li)子(zi)(zi)等，也(ye)可以(yi)(yi)(yi)用(yong)有類似(si)特點的(de)(de)(de)領域，如(ru)食品(pin)、醫(yi)藥、臨床、法庭分(fen)析(xi)等方(fang)面(mian)。自然，在脂質(zhi)組學中(zhong)也(ye)會使(shi)(shi)用(yong)這(zhe)(zhe)一技術(shu)。

　　武漢大學曾(ceng)昭睿研究組用(yong)自制的甲基(ji)丙烯(xi)酸丁酯(zhi)/端(duan)羥(qian)基(ji)硅油萃(cui)取(qu)頭，萃(cui)取(qu)肺組織(zhi)中的長鏈脂肪(fang)酸(表2文獻31)。F Pragst 利用(yong)SPME萃(cui)取(qu)頭發中的脂肪(fang)酸乙酯(zhi)和葡萄糖苷酸乙酯(zhi)來診斷過度酗酒(表2文獻32)。脂質中的脂肪(fang)酸都可(ke)以衍生化為酯(zhi)類(lei)用(yong)SPME進行萃(cui)取(qu)。

　　SPME 的(de)魅力(li)在(zai)于(yu)它可以進(jin)行(xing)活體樣品中(zhong)萃取分(fen)析物，用于(yu)代謝(xie)(xie)組學和脂(zhi)質組學的(de)研(yan)究，對(dui)這(zhe)一(yi)課題(ti)SPME的(de)發明人(ren) Pawliszyn 近(jin)年進(jin)行(xing)了闡述(Angew Chem， 2013, 125：12346 –12348;Anal Chem， 2014, 86：12022−12029)。分(fen)析脂(zhi)質代謝(xie)(xie)產物中(zhong)游(you)離(li)脂(zhi)肪酸的(de)示意圖如下。

(Anal Chem， 2014, 86：12022−12029)

6、超臨界流體萃取(SFE)

　　超(chao)(chao)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)流(liu)體(ti)(ti)(ti)具有特(te)殊的(de)(de)(de)理化(hua)(hua)特(te)性(xing)，黏(nian)度(du)為普(pu)通(tong)(tong)流(liu)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)1%～10%;擴散系數約為普(pu)通(tong)(tong)液體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)10～100倍;密(mi)度(du)比常(chang)壓(ya)氣體(ti)(ti)(ti)大100～1 000倍。因而超(chao)(chao)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)流(liu)體(ti)(ti)(ti)既有液體(ti)(ti)(ti)溶解(jie)能力(li)大的(de)(de)(de)特(te)點，又有氣體(ti)(ti)(ti)易(yi)于(yu)擴散和(he)運動(dong)的(de)(de)(de)特(te)性(xing)，傳質(zhi)(zhi)速率(lv)大大高(gao)于(yu)液相過(guo)程。所以從(cong)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)效(xiao)率(lv)和(he)對環境友好(hao)都受到歡迎。最常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)超(chao)(chao)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)流(liu)體(ti)(ti)(ti)是超(chao)(chao)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳(SF-CO2)它的(de)(de)(de)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)壓(ya)力(li)和(he)溫度(du)低，只有7.4MPa和(he)32℃。SF-CO2無毒易(yi)于(yu)從(cong)樣品(pin)中排(pai)除，其極性(xing)與(yu)戊烷近似，很適于(yu)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)疏水性(xing)化(hua)(hua)合物，如脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)化(hua)(hua)合物(J Chromatogr A 2007,1163:2-24)。為了分離(li)極性(xing)化(hua)(hua)合物往二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳中加(jia)入改性(xing)劑，如甲醇。過(guo)去更多的(de)(de)(de)工作(zuo)時從(cong)植(zhi)物類物質(zhi)(zhi)中萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，但是近來已經擴展(zhan)到從(cong)動(dong)物組織中萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)，例如浙(zhe)江大學藥學院王(wang)龍虎(hu)利(li)用(yong)江蘇省南(nan)通(tong)(tong)市華安超(chao)(chao)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)有限公司的(de)(de)(de) HA220-50-06 SFE裝(zhuang)置萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)鴕鳥脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)中的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)酸：萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)裝(zhuang)置包括一(yi)個(ge)1 L 不銹鋼萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)釜，兩個(ge)1 L 分離(li)器(qi)，一(yi)個(ge)注射泵(beng)，和(he)一(yi)個(ge)冷凝裝(zhuang)置。用(yong)壓(ya)力(li)調(diao)(diao)(diao)節器(qi)調(diao)(diao)(diao)節壓(ya)力(li)，用(yong)可(ke)調(diao)(diao)(diao)節溫度(du)的(de)(de)(de)水浴(yu)控制溫度(du)，通(tong)(tong)過(guo)調(diao)(diao)(diao)節泵(beng)的(de)(de)(de)頻率(lv)來控制二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳的(de)(de)(de)流(liu)速。從(cong)液態(tai)二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳鋼瓶把二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳送(song)到萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)器(qi)中，并達(da)到超(chao)(chao)臨(lin)(lin)(lin)(lin)界(jie)(jie)狀(zhuang)態(tai)，在分離(li)器(qi)中調(diao)(diao)(diao)節壓(ya)力(li)和(he)溫度(du)可(ke)把萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)出來的(de)(de)(de)組分里出來。試驗(yan)中取(qu)(qu)(qu)250 g鴕鳥脂(zhi)(zhi)(zhi)肪(fang)組織用(yong)二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)5h，壓(ya)力(li)15–30 MPa，溫度(du)40–50℃，二(er)(er)氧(yang)化(hua)(hua)碳流(liu)速為15–35 L/h，用(yong)以考(kao)察萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)效(xiao)果。(Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2011, 113, 775–779)。

　　但是SFE更(geng)重要(yao)(yao)的是萃取(qu)人干血漿斑點中的脂(zhi)(zhi)質分子，Uchikata等(表2文獻33)比較(jiao)了(le)用(yong)SFE和(he)液液萃取(qu)(Bligh 和(he) Dyer方(fang)法)磷(lin)脂(zhi)(zhi)的效(xiao)果，證明SFE要(yao)(yao)比液液萃取(qu)方(fang)法對(dui)磷(lin)脂(zhi)(zhi)具有更(geng)好的選擇性，包括(kuo)磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(PC)、溶血性磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(lysoPC)、磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)乙醇胺(PE)和(he)神(shen)經鞘(qiao)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(SM)。國內在1995年就有類似(si)研究(薄(bo)層掃(sao)描法測定蛋黃磷(lin)脂(zhi)(zhi)中PC、SM和(he)LPC的含量­——路萍 賴炳森，藥(yao)物分析雜志，1995，(13):231-232)，他們也(ye)是用(yong)SFE萃取(qu)之后進行薄(bo)層色譜分離。

7、微波輔助萃取(MAE)

　　微(wei)波(bo)輔助萃(cui)取(MAE)是利用微(wei)波(bo)能(neng)強化溶(rong)劑(ji)萃(cui)取效率，即利用微(wei)波(bo)加(jia)熱來加(jia)速溶(rong)劑(ji)對(dui)固體樣(yang)品(pin)中目標萃(cui)取物的(de)萃(cui)取過程。MAE 可以快速高效地把(ba)樣(yang)品(pin)及溶(rong)劑(ji)中的(de)偶極(ji)分子在(zai)高頻(pin)(pin)微(wei)波(bo)能(neng)的(de)作用下，產生偶極(ji)渦流，離子傳導和高頻(pin)(pin)率摩擦，從而在(zai)短(duan)時(shi)間(jian)內(nei)產生大量的(de)熱量。偶極(ji)分子旋轉導致(zhi)的(de)弱氫鍵破裂(lie)、離子遷移等加(jia)速了溶(rong)劑(ji)分子對(dui)樣(yang)品(pin)基體的(de)滲透，待分析(xi)成(cheng)分很快溶(rong)劑(ji)化，使(shi)微(wei)波(bo)萃(cui)取時(shi)間(jian)顯著縮短(duan)。

　　微波(bo)加(jia)熱具有選擇性(xing)微波(bo)對(dui)介(jie)電(dian)(dian)性(xing)質(zhi)不同的(de)物料呈現出選擇性(xing)的(de)加(jia)熱特點，介(jie)電(dian)(dian)常(chang)數及介(jie)質(zhi)損(sun)耗小的(de)物料，對(dui)微波(bo)的(de)入射可以說是(shi)“透明”的(de)。溶質(zhi)和溶劑的(de)極性(xing)越(yue)(yue)大(da)，對(dui)微波(bo)能的(de)吸收越(yue)(yue)大(da)，升溫越(yue)(yue)快，促進了萃取(qu)(qu)速度。而對(dui)于不吸收微波(bo)的(de)非極性(xing)溶劑，微波(bo)幾乎不起加(jia)熱作用。所(suo)以，在選擇萃取(qu)(qu)劑時一定要考慮(lv)到(dao)溶劑的(de)極性(xing)，以達到(dao)最(zui)佳效果(guo)。

　　MAE具有生(sheng)物(wu)效應(非熱效應) ，由于大多數生(sheng)物(wu)體(ti)內(nei)含(han)有極性水分(fen)(fen)子(zi)，在(zai)微波場的作(zuo)用下引起(qi)強烈的極性震蕩，從(cong)而導致細(xi)胞分(fen)(fen)子(zi)間氫鍵松弛，細(xi)胞膜(mo)結構電擊(ji)穿破裂，加速了溶劑分(fen)(fen)子(zi)對基(ji)體(ti)的滲透和待提取成分(fen)(fen)的溶劑化。因此，利用MAE從(cong)生(sheng)物(wu)基(ji)體(ti)萃取待分(fen)(fen)析的成分(fen)(fen)時，能提高萃取效率。(李核等，分(fen)(fen)析化學，2003,31(109)：126l～1268)

　　例(li)如(ru)：萬益群(qun)，吳世芳利用MAE萃(cui)(cui)取(qu)何首烏中的(de)(de)磷脂(分(fen)析(xi)測(ce)試學報，2008,27(7)：782—784)，方法如(ru)下：確(que)稱取(qu)約1.0 g何首烏樣(yang)品于溶(rong)(rong)樣(yang)杯中，加(jia)入20 mL萃(cui)(cui)取(qu)溶(rong)(rong)劑(氯仿與甲醇體積 比為(wei)(wei)1：2)，把溶(rong)(rong)樣(yang)杯放入罐體中，組裝(zhuang)好罐體后放入微波(bo)制樣(yang)系統中，插(cha)入溫(wen)度(du)探(tan)針。設置萃(cui)(cui)取(qu)壓(ya)力為(wei)(wei)安全(quan)壓(ya)力(1.5 MPa)，萃(cui)(cui)取(qu)時間15 min，溫(wen)度(du)為(wei)(wei)45℃。微波(bo)萃(cui)(cui)取(qu)完畢后，將樣(yang)品過濾(lv)(lv)。濾(lv)(lv)液(ye)用體積為(wei)(wei)濾(lv)(lv)液(ye)總(zong)體積l/4的(de)(de)8 g/L氯化鈉溶(rong)(rong)液(ye)萃(cui)(cui)取(qu)2次(ci)，收集有(you)機相(xiang)。將有(you)機相(xiang)旋轉濃縮至(zhi)近干(gan)，用甲醇定(ding)容至(zhi)10 mL。取(qu)樣(yang)品溶(rong)(rong)液(ye)3 mL用甲醇稀(xi)釋至(zhi)10 mL，過0.45μm微孔(kong)濾(lv)(lv)膜，待測(ce)。

7、超聲輔助萃取(UAE)

　　超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)為頻(pin)率(lv)高于20kHz以(yi)(yi)(yi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)，是(shi)一(yi)(yi)種機械振動(dong)在(zai)(zai)介質中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)傳(chuan)播過(guo)(guo)程，在(zai)(zai)傳(chuan)播過(guo)(guo)程中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)與介質的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作用(yong)(yong)(yong)(yong)，可以(yi)(yi)(yi)使(shi)(shi)超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)位(wei)和幅度等發生(sheng)(sheng)變化(hua);功(gong)(gong)率(lv)超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)則會(hui)使(shi)(shi)介質的(de)(de)(de)(de)狀態、組(zu)成、結構和功(gong)(gong)能等發生(sheng)(sheng)變化(hua)，超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)應用(yong)(yong)(yong)(yong)可分為兩類：一(yi)(yi)類是(shi)頻(pin)率(lv)高，能量低(一(yi)(yi)般(ban)小于1W/cm2)的(de)(de)(de)(de)檢測超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)，其(qi)頻(pin)率(lv)多以(yi)(yi)(yi)MHz為單位(wei);另一(yi)(yi)類是(shi)頻(pin)率(lv)低，能量高(通常為10—100 W/cmz)的(de)(de)(de)(de)功(gong)(gong)率(lv)超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)，其(qi)頻(pin)率(lv)則以(yi)(yi)(yi)kHz為單位(wei)。UAE是(shi)一(yi)(yi)種重復(fu)性好、萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)質量高的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)(fang)法(fa)，它(ta)不(bu)像MAE，不(bu)會(hui)讓萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)系統的(de)(de)(de)(de)溫度升高，不(bu)利于熱穩定(ding)差的(de)(de)(de)(de)代(dai)謝(xie)物萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)。UAE還(huan)可以(yi)(yi)(yi)和液(ye)液(ye)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)配合改進(jin)生(sheng)(sheng)物樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)脂(zhi)(zhi)質的(de)(de)(de)(de)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)效率(lv)。例(li)如(ru)(ru)上(shang)海(hai)交通大學藥學院的(de)(de)(de)(de)劉玉敏(min)等(Anal Bioanal Chem，2011， 400：1405–1417)成功(gong)(gong)地開發了(le)UAE 和 LLE結合萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)人(ren)血清樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)代(dai)謝(xie)產物，從而比單獨使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)液(ye)液(ye)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)提高5–60%。Pizarro等使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)類似的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)(fang)法(fa)以(yi)(yi)(yi)MTBE作溶劑輔以(yi)(yi)(yi)UAE萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)人(ren)血中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質，比單純使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)(yong)MTBE的(de)(de)(de)(de)液(ye)液(ye)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)可以(yi)(yi)(yi)多檢出30%的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質種類，MTBE-UAE萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)方(fang)(fang)(fang)法(fa)具有更好的(de)(de)(de)(de)重復(fu)性，相(xiang)對標(biao)準偏差降低6%，脂(zhi)(zhi)質成分的(de)(de)(de)(de)回收(shou)率(lv)提高7成(表(biao)2文獻36)。除去萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)生(sheng)(sheng)物液(ye)體(ti)外，UAE-LLE也用(yong)(yong)(yong)(yong)于萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)，例(li)如(ru)(ru)哈爾賓醫科大學的(de)(de)(de)(de)李穎等研(yan)究了(le)用(yong)(yong)(yong)(yong)UAE-LLE萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)鼠的(de)(de)(de)(de)肝(gan)臟(zang)組(zu)織，考察(cha)了(le)超(chao)(chao)(chao)(chao)聲(sheng)(sheng)(sheng)波(bo)功(gong)(gong)率(lv)、萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)溶劑、萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)容積、萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)時(shi)間(jian)等，結果表(biao)明(ming)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)時(shi)間(jian)比Folch萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)法(fa)萃(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)(qu)脂(zhi)(zhi)肪(fang)酸(suan)從12 h 縮短到 20 min，回收(shou)率(lv)在(zai)(zai)87–120%之間(jian)。(J Chromatogr Sci， 2013;51:376–382)

8、其他可用的萃取方法

　　在化學分析樣(yang)(yang)品(pin)處(chu)理(li)中(zhong)還有兩(liang)種重要的樣(yang)(yang)品(pin)前(qian)(qian)處(chu)理(li)方(fang)法，即加速(su)溶劑萃(cui)取(ASE)和(he)基質固相分散萃(cui)取(MSPD)，可以用于脂質組學研究的樣(yang)(yang)品(pin)前(qian)(qian)處(chu)理(li)。

　　加速(su)溶(rong)(rong)劑(ji)萃取(qu)(qu)(Accelrated Solvent Extraction, ASE)，這(zhe)一(yi)(yi)方法(fa)(fa)(fa)是(shi)一(yi)(yi)種在提高(gao)溫度和壓力的(de)(de)條件(jian)下(xia)，用(yong)(yong)(yong)有機溶(rong)(rong)劑(ji)萃取(qu)(qu)的(de)(de)自動化方法(fa)(fa)(fa)。與其他液(ye)體(ti)萃取(qu)(qu)方法(fa)(fa)(fa)相比(bi)，其突出的(de)(de)優(you)點是(shi)有機溶(rong)(rong)劑(ji)用(yong)(yong)(yong)量(liang)少、快速(su)、回收率高(gao)。(牟世芬等(deng)，現(xian)代分析儀器(qi)，2001，(3)：18-20)。 Spiric A等(deng)使(shi)用(yong)(yong)(yong)ASE萃取(qu)(qu)鯉(li)魚肉(rou)中的(de)(de)脂(zhi)肪酸譜(pu)和膽(dan)固醇含量(liang)，并與改進(jin)的(de)(de)索氏萃取(qu)(qu)法(fa)(fa)(fa)進(jin)行(xing)比(bi)較，表明ASE萃取(qu)(qu)方法(fa)(fa)(fa)是(shi)可用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)。(Anal Chim Acta，2010， 672：66–71)。Jansen B等(deng)利用(yong)(yong)(yong)ASE從(cong)土壤中萃取(qu)(qu)脂(zhi)質(zhi)生物標記物，萃取(qu)(qu)效果和其他萃取(qu)(qu)方法(fa)(fa)(fa)一(yi)(yi)樣(Appl Geochem ，2006， 21：1006–1015)。Balasubramanian R K等(deng)用(yong)(yong)(yong)ASE和其他方法(fa)(fa)(fa)進(jin)行(xing)了從(cong)海水微海藻細胞(bao)中萃取(qu)(qu)脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)研(yan)究，表明ASE是(shi)一(yi)(yi)種可以(yi)使(shi)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)方法(fa)(fa)(fa)(Chem Engineering J，2013， 215–216：929–936)。

　　MSPD方法(fa)是(shi)1989年(nian)首次提出是(shi)用(yong)(yong)來(lai)處理動(dong)物(wu)(wu)組織(zhi)樣(yang)品的(de)(de)方法(fa)，樣(yang)品與(yu)涂漬(zi)有(you)C18等的(de)(de)各種聚合(he)(he)物(wu)(wu)載(zai)體的(de)(de)固相萃(cui)取(qu)材料一起研磨，得(de)到半干狀態的(de)(de)混合(he)(he)物(wu)(wu)并將(jiang)其作(zuo)(zuo)為填料裝(zhuang)柱(zhu)，然后用(yong)(yong)不同的(de)(de)的(de)(de)溶液洗(xi)脫柱(zhu)子(zi)，將(jiang)各種待測物(wu)(wu)洗(xi)脫下來(lai)。其依據是(shi)采(cai)用(yong)(yong)脂溶性材料(C18)破(po)壞細胞膜并將(jiang)組織(zhi)分(fen)(fen)(fen)散，C18充當分(fen)(fen)(fen)散劑(ji)(ji)。在(zai)硅膠固相萃(cui)取(qu)材料表面(mian)鍵合(he)(he)有(you)機(ji)相，與(yu)傳(chuan)統(tong)方法(fa)使用(yong)(yong)砂子(zi)做吸附劑(ji)(ji)類似，在(zai)樣(yang)品與(yu)固體材料攪拌(ban)的(de)(de)過程(cheng)中(zhong)，利(li)用(yong)(yong)剪(jian)切力作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)將(jiang)組織(zhi)分(fen)(fen)(fen)散。鍵合(he)(he)的(de)(de)有(you)機(ji)相就像(xiang)溶劑(ji)(ji)或洗(xi)滌(di)劑(ji)(ji)一樣(yang)，將(jiang)樣(yang)品組分(fen)(fen)(fen)溶解和分(fen)(fen)(fen)散在(zai)支持物(wu)(wu)表面(mian)。這大大增(zeng)加了萃(cui)取(qu)樣(yang)品的(de)(de)表面(mian)積，樣(yang)品按(an)各自極(ji)(ji)性分(fen)(fen)(fen)布在(zai)有(you)機(ji)相中(zhong)，如(ru)非(fei)極(ji)(ji)性組分(fen)(fen)(fen)分(fen)(fen)(fen)散在(zai)非(fei)極(ji)(ji)性有(you)機(ji)相中(zhong)，極(ji)(ji)性小(xiao)分(fen)(fen)(fen)子(zi)與(yu)硅膠上(shang)的(de)(de)硅烷醇結合(he)(he)，大的(de)(de)弱(ruo)極(ji)(ji)性分(fen)(fen)(fen)子(zi)則分(fen)(fen)(fen)散在(zai)多相物(wu)(wu)質(zhi)表面(mian)。(烏日娜等，食(shi)品科(ke)學(xue)，2006,26(6)：266-268)。香港城市(shi)大學(xue)的(de)(de)Qing Shen等利(li)用(yong)(yong)二氧化鈦納米顆(ke)粒(li)作(zuo)(zuo)萃(cui)取(qu)劑(ji)(ji)，以基質(zhi)固相分(fen)(fen)(fen)散萃(cui)取(qu)方法(fa)進(jin)行橄欖果的(de)(de)脂質(zhi)組學(xue)研究，研究證明(ming)這一方法(fa)可(ke)以把磷脂從非(fei)磷脂中(zhong)完全(quan)選擇(ze)性地分(fen)(fen)(fen)離出來(lai)。(Food Research Int，2013， 54：2054–2061)。

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