與化學仿制藥相比，生物類似藥雖然也屬(shu)于仿制藥(yao)范疇，但其不僅投資門(men)檻更(geng)高(gao)，技術門(men)檻也更(geng)高(gao)。

　　三大(da)技術門檻

　　生物類(lei)似藥的技術門檻高至少表現在三大方面：

　　一是(shi)有關生產、制造過程和工藝(yi)流程。在(zai)產品生產過程中(zhong)(zhong)，有多種因素可能會(hui)影(ying)響到生物(wu)類似(si)藥(yao)的(de)質量，如分子設計(ji)、表達系(xi)統(tong)、細胞株類型(xing)、翻(fan)譯后修飾(PTM)、不純物(wu)和污染物(wu)、配方和輔料、包裝容器、生產過程中(zhong)(zhong)的(de)蛋白降解等。

　　二是(shi)對(dui)生物類(lei)似藥在質(zhi)量、安全性(xing)和有效性(xing)(QSE)等方面進行分析檢測、表征，需要(yao)(yao)(yao)在臨床(chuang)試驗前在蛋白的多(duo)種(zhong)性(xing)質(zhi)上(shang)與原(yuan)研藥參考品一致。這種(zhong)一致性(xing)，根據歐盟EMA的要(yao)(yao)(yao)求(qiu)(qiu)需要(yao)(yao)(yao)“相(xiang)似”(similar)。而根據美(mei)國FDA的要(yao)(yao)(yao)求(qiu)(qiu)則需要(yao)(yao)(yao)“高度相(xiang)似”(highly similar)。如果(guo)是(shi)可以自動替換(huan)(interchangeable)的生物類(lei)似藥，其要(yao)(yao)(yao)求(qiu)(qiu)更高。

　　上面兩大高(gao)(gao)門檻(jian)對(dui)于中國藥企(qi)而言更是(shi)意味(wei)著投資的(de)高(gao)(gao)門檻(jian)，因(yin)為無論是(shi)上下游的(de)工藝開發、生產還是(shi)分析方法開發、質量(liang)檢測(ce)，所(suo)需儀器設(she)備甚至耗材幾乎都需要(yao)進口(kou)。

　　第三(san)個方面(mian)是(shi)生(sheng)物(wu)原研藥的專(zhuan)利壁壘。生(sheng)物(wu)藥的專(zhuan)利要遠比(bi)化學藥復雜(za)，這個高門檻很容易被投資人忽視。艾伯維(Abbvie)和安進(jin)(Amgen)因Humira(修美樂)的生(sheng)物(wu)類似藥的專(zhuan)利之戰僅僅是(shi)一個例子。現在風頭正勁的免(mian)疫(yi)腫瘤(liu)抗(kang)體藥(尤其是(shi)已經上市(shi)的兩個PD-1抗(kang)體藥)以(yi)后很可能成為被仿制的熱點目標，但免(mian)疫(yi)腫瘤(liu)領域近(jin)期多起專(zhuan)利訴(su)訟也說明：即使是(shi)做原研生(sheng)物(wu)藥，專(zhuan)利問題也需要防范。

　　出于工作(zuo)關系和(he)個人興趣，筆(bi)者(zhe)本文僅(jin)談談生物(wu)類(lei)似藥(yao)的(de)分(fen)析技術。如(ru)表(biao)(biao)格所示，生物(wu)類(lei)似藥(yao)的(de)表(biao)(biao)征分(fen)析，涉及許(xu)多生物(wu)化學和(he)生物(wu)物(wu)理技術，筆(bi)者(zhe)對(dui)于大(da)多數(shu)技術略知一二，本文無意具體(ti)談這(zhe)些分(fen)析技術的(de)細節和(he)難度，而只是(shi)通過簡單評論(lun)這(zhe)些技術手段(duan)，試圖說明進入生物(wu)類(lei)似藥(yao)的(de)門檻很高。

　　質控蛋(dan)白三大性質

　　與(yu)評(ping)價化學藥類似，對于生物藥的(de)評(ping)價，質量、安(an)全性(xing)和有(you)(you)效性(xing)可(ke)以說是最重要的(de)三個方面，而質量又是安(an)全性(xing)和有(you)(you)效性(xing)的(de)前提(ti)和基礎。

　　對(dui)于生物藥的質量，FDA認為治(zhi)療性蛋(dan)白的三(san)大方面性質雖(sui)然不(bu)能(neng)被完全充分測定，但對(dui)于評價蛋(dan)白藥是(shi)非常重要的，這(zhe)三(san)大性質即(ji)：PTM、蛋(dan)白高級結構和蛋(dan)白聚(ju)集，下面將(jiang)分別簡單(dan)介紹。

　　蛋白的(de)翻譯后(hou)修飾(PTM)

　　蛋白的翻譯(yi)后修(xiu)飾(PTM)有很多種(zhong)，常(chang)見(jian)的包括糖(tang)基(ji)化(hua)(hua)(hua)(又(you)可(ke)細分為(wei)：半乳糖(tang)苷(gan)基(ji)化(hua)(hua)(hua)、巖藻糖(tang)基(ji)化(hua)(hua)(hua)、唾液酸糖(tang)苷(gan)化(hua)(hua)(hua)等)、氧(yang)化(hua)(hua)(hua)、磷酸化(hua)(hua)(hua)、硫(liu)酸化(hua)(hua)(hua)、脂化(hua)(hua)(hua)、二硫(liu)鍵形成和(he)脫(tuo)酰胺。這(zhe)些(xie)化(hua)(hua)(hua)學變化(hua)(hua)(hua)大多是在(zai)細胞內發生的，但有些(xie)也可(ke)能(neng)發生在(zai)生產的各個階段(如(ru)純化(hua)(hua)(hua)和(he)儲存過(guo)程)。

　　現在的(de)科學研究已經表明，蛋(dan)白(bai)的(de)PTM會影(ying)響(xiang)(xiang)蛋(dan)白(bai)的(de)活(huo)性(xing)和(he)免(mian)疫原性(xing)。蛋(dan)白(bai)的(de)PTM還可能改(gai)變蛋(dan)白(bai)的(de)結構進而引起聚集，從而進一步影(ying)響(xiang)(xiang)蛋(dan)白(bai)的(de)免(mian)疫原性(xing)。

　　因此(ci)，需要在蛋(dan)(dan)(dan)白類藥物生產(chan)的(de)各個階段(duan)對(dui)蛋(dan)(dan)(dan)白質的(de)PTM進行檢(jian)測。對(dui)于(yu)單一成分的(de)純化蛋(dan)(dan)(dan)白藥，PTM的(de)檢(jian)測和監(jian)測則(ze)相對(dui)容易一些。而對(dui)于(yu)含(han)有許多種(zhong)蛋(dan)(dan)(dan)白質的(de)復(fu)雜(za)混合物蛋(dan)(dan)(dan)白藥物(如有些預(yu)防(fang)性(xing)疫苗)，即使是采用蛋(dan)(dan)(dan)白質組學技術，檢(jian)測所有蛋(dan)(dan)(dan)白的(de)PTM也是非常大的(de)挑戰(zhan)。

　　研(yan)究(jiu)蛋(dan)白PTM的(de)(de)最有力(li)的(de)(de)利(li)器當(dang)是(shi)生(sheng)(sheng)物(wu)質譜(pu)了，主要是(shi)基于(yu)電(dian)噴霧(ESI)和基質輔助(zhu)激光(guang)解離(MALDI)兩種技術(shu)。近年(nian)來，質譜(pu)在生(sheng)(sheng)物(wu)類似藥(yao)領域的(de)(de)應用明顯增多，在近幾年(nian)的(de)(de)美(mei)國質譜(pu)協會會議上，每(mei)年(nian)都有不少(shao)口頭報告或墻報是(shi)直接用質譜(pu)研(yan)究(jiu)生(sheng)(sheng)物(wu)類似藥(yao)PTM的(de)(de)，其中糖基化研(yan)究(jiu)占比最大。

　　但是，由于生(sheng)物質譜價格昂貴，動輒幾十(shi)萬美元，高端的(de)(de)售(shou)價甚至在(zai)50萬美元以上(shang)，這也限制了生(sheng)物質譜在(zai)包(bao)括生(sheng)物類似藥在(zai)內的(de)(de)生(sheng)物制藥領域的(de)(de)應(ying)用。

　　蛋白的高級結構(gou)

　　蛋(dan)(dan)白的(de)高級結(jie)(jie)構(gou)(gou)是(shi)指蛋(dan)(dan)白的(de)二(er)級、三級和(he)四級結(jie)(jie)構(gou)(gou)，這些結(jie)(jie)構(gou)(gou)特性決定了蛋(dan)(dan)白的(de)三維空間結(jie)(jie)構(gou)(gou)，進而最(zui)終決定了蛋(dan)(dan)白的(de)功能和(he)活性。因(yin)此，比較生(sheng)物(wu)類(lei)似藥(yao)(指蛋(dan)(dan)白藥(yao))和(he)原研藥(yao)的(de)蛋(dan)(dan)白高級結(jie)(jie)構(gou)(gou)，是(shi)證明兩只藥(yao)相似的(de)重要手段。

　　X-射線(xian)衍射和核磁共振(NMR)是公認的測定蛋(dan)白質三維空間結(jie)構(gou)的兩種(zhong)最主要的技(ji)術。但是，對于生物類似(si)藥(yao)和原(yuan)研藥(yao)的結(jie)構(gou)相似(si)性研究，這兩種(zhong)技(ji)術都有很(hen)大的挑戰。

　　對于(yu)(yu)X-射(she)線衍射(she)而言，需要耗(hao)時較(jiao)長(chang)的蛋白結晶過程和(he)數據解(jie)析(xi)過程，對于(yu)(yu)樣品量較(jiao)大的工業界而言，顯(xian)然(ran)不(bu)能滿足高通量的要求。而NMR不(bu)但(dan)價格昂貴、靈敏度相對較(jiao)低、數據分(fen)(fen)析(xi)耗(hao)時長(chang)，對于(yu)(yu)分(fen)(fen)析(xi)分(fen)(fen)子(zi)量達(da)150kDa的大分(fen)(fen)子(zi)抗體藥也面臨(lin)很大的挑戰，所以NMR在生物(wu)類似藥領域注定(ding)應用非常有(you)限(xian)。

　　另外，還有(you)(you)其它一(yi)些(xie)經典生(sheng)物物理技(ji)術(shu)被用于表(biao)征蛋白(bai)(bai)的(de)(de)結(jie)(jie)構，如圓(yuan)二色(se)性(xing)譜(pu)(pu)、傅里(li)葉(xie)變(bian)(bian)換紅外光(guang)譜(pu)(pu)、熒光(guang)光(guang)譜(pu)(pu)、差示掃描量(liang)熱法、分(fen)析超速(su)離(li)心、排阻(zu)色(se)譜(pu)(pu)以(yi)(yi)及各種(zhong)染料結(jie)(jie)合鑒(jian)別(bie)技(ji)術(shu)等。這(zhe)些(xie)技(ji)術(shu)一(yi)個(ge)最(zui)主要的(de)(de)限制，就是只(zhi)能檢(jian)測(ce)來自蛋白(bai)(bai)不同(tong)部位的(de)(de)某(mou)(mou)一(yi)種(zhong)總(zong)的(de)(de)信號(hao)。從這(zhe)些(xie)測(ce)定得(de)到的(de)(de)信息只(zhi)能得(de)到生(sheng)物藥整個(ge)結(jie)(jie)構的(de)(de)總(zong)的(de)(de)平均(jun)值。比如：圓(yuan)二色(se)性(xing)譜(pu)(pu)測(ce)定就只(zhi)能表(biao)明某(mou)(mou)一(yi)種(zhong)主要的(de)(de)二級(ji)結(jie)(jie)構(阿(a)爾法螺旋、b折(zhe)疊和無規(gui)卷曲)的(de)(de)平均(jun)百分(fen)比。如果(guo)一(yi)個(ge)含(han)有(you)(you)多個(ge)阿(a)爾法螺旋結(jie)(jie)構的(de)(de)蛋白(bai)(bai)，其中只(zhi)有(you)(you)一(yi)個(ge)阿(a)爾法螺旋結(jie)(jie)構和另一(yi)蛋白(bai)(bai)相比發生(sheng)了變(bian)(bian)化(hua)，但是即使這(zhe)一(yi)變(bian)(bian)化(hua)相對(dui)較大，被另外不變(bian)(bian)的(de)(de)阿(a)爾法螺旋平均(jun)以(yi)(yi)后，圓(yuan)二色(se)性(xing)譜(pu)(pu)所(suo)能測(ce)到的(de)(de)變(bian)(bian)化(hua)也可能很小，甚至沒(mei)有(you)(you)可以(yi)(yi)測(ce)量(liang)出的(de)(de)變(bian)(bian)化(hua)。所(suo)以(yi)(yi)這(zhe)些(xie)經典生(sheng)物物理技(ji)術(shu)不能用于檢(jian)測(ce)生(sheng)物藥很小的(de)(de)結(jie)(jie)構變(bian)(bian)化(hua)。

　　更靈敏的技(ji)術則是(shi)(shi)氫(qing)氘交換(huan)質(zhi)譜(pu)(HDX-MS)，這也(ye)進一步(bu)顯示質(zhi)譜(pu)技(ji)術在比較(jiao)生物(wu)(wu)類似(si)藥(yao)和原(yuan)研藥(yao)結構(gou)方(fang)(fang)面(mian)(mian)的重(zhong)要(yao)性。現(xian)代生物(wu)(wu)質(zhi)譜(pu)技(ji)術在生物(wu)(wu)藥(yao)領域(yu)的應用已(yi)經遠不僅(jin)僅(jin)是(shi)(shi)做蛋白質(zhi)鑒(jian)定(ding)、分(fen)子量(liang)測(ce)定(ding)、氨(an)基酸(suan)序列測(ce)定(ding)，蛋白結構(gou)只是(shi)(shi)其(qi)多種新應用的一個方(fang)(fang)面(mian)(mian)。

　　蛋白聚(ju)集(ji)

　　蛋白(bai)(bai)聚集是(shi)蛋白(bai)(bai)藥生產過程(cheng)中很頭疼的問題(ti)，尤其是(shi)對于(yu)高濃度的蛋白(bai)(bai)溶液，很容易引起(qi)蛋白(bai)(bai)聚集。單(dan)體(ti)蛋白(bai)(bai)的聚集過程(cheng)可以是(shi)可逆的，也可能(neng)是(shi)不可逆的，其聚集后的大小可以從二聚體(ti)到包含上萬億個蛋白(bai)(bai)單(dan)體(ti)的肉(rou)眼可見的顆粒。

　　總(zong)的(de)來說，蛋白(bai)(bai)聚集(ji)對于(yu)任何蛋白(bai)(bai)藥都(dou)是問題。蛋白(bai)(bai)聚集(ji)不但會降低蛋白(bai)(bai)藥的(de)有效劑量，更(geng)大的(de)問題是可(ke)能會引起毒副作(zuo)(zuo)用和免疫(yi)反應。一般而言，蛋白(bai)(bai)分子量越(yue)大，其免疫(yi)原性越(yue)強。在某些特殊情況下，這些難以預料(liao)的(de)副作(zuo)(zuo)用甚(shen)至可(ke)能是致命的(de)。

　　因此，蛋(dan)白(bai)(bai)聚(ju)集必須被檢測、定量和表(biao)征，用以比較(jiao)生(sheng)物類似藥(yao)和原研藥(yao)。如表(biao)中所示，表(biao)征蛋(dan)白(bai)(bai)聚(ju)集的主要分析技術包括(kuo)排(pai)阻-高效(壓)液相色譜(SEC-HPLC)、凝膠電(dian)泳、分析超速離(li)心、光散射法等。

　　由于簡(jian)單、易用(yong)、廉價、快速、樣品用(yong)量少等特點，SEC-HPLC是目前檢測蛋白(bai)聚(ju)(ju)集的(de)最常用(yong)方法。當然，SEC-HPLC也有自己的(de)缺(que)點，如較大的(de)蛋白(bai)聚(ju)(ju)體(ti)可能在進(jin)樣上柱(zhu)時就被除去，造成(cheng)假陰性。

　　這也進一(yi)步說明(ming)，沒有(you)任何(he)一(yi)種(zhong)十(shi)全十(shi)美(mei)的(de)分析技術。正(zheng)是(shi)緣于此，美(mei)國(guo)FDA和ICH(國(guo)際人用(yong)藥(yao)(yao)注(zhu)冊(ce)技術協(xie)調會議)都(dou)建(jian)議生物類(lei)似藥(yao)(yao)研發(fa)企業(ye)不但要(yao)檢測蛋(dan)白不同種(zhong)性(xing)(xing)質(zhi)，也建(jian)議采用(yong)多(duo)種(zhong)技術檢測同一(yi)種(zhong)性(xing)(xing)質(zhi)，以(yi)盡量得到更(geng)全面的(de)生物類(lei)似藥(yao)(yao)和原研藥(yao)(yao)可以(yi)比較的(de)多(duo)種(zhong)信息，如(ru)理(li)化性(xing)(xing)質(zhi)、生物活性(xing)(xing)、免疫化學(xue)性(xing)(xing)質(zhi)、純(chun)度、不純(chun)物和污染物等(deng)。

　　相似度界定：Case By Case?

　　值得一提的(de)(de)是，生物類似(si)藥有兩個常用(yong)且易于(yu)混淆的(de)(de)概念：可比性(xing)(xing)(comparability)和相似(si)性(xing)(xing)(similarity)。

　　ICH明確定(ding)義和限(xian)制“可(ke)(ke)比(bi)(bi)性(xing)”是指同(tong)(tong)一(yi)家生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)商所(suo)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)的原(yuan)研藥(yao)(yao)(包括(kuo)批(pi)準上市后(hou)階段(duan))，在生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)工(gong)藝變(bian)化(如放(fang)大)后(hou)，兩(liang)種工(gong)藝所(suo)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)的同(tong)(tong)一(yi)產(chan)品(當(dang)然不可(ke)(ke)能(neng)100%相(xiang)同(tong)(tong))的可(ke)(ke)比(bi)(bi)性(xing)(參(can)見(jian)ICH Q5E指導性(xing)文件：Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process，生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)過程(cheng)變(bian)化后(hou)生(sheng)(sheng)(sheng)物工(gong)程(cheng)/生(sheng)(sheng)(sheng)物產(chan)品的可(ke)(ke)比(bi)(bi)性(xing))。而“相(xiang)似(si)性(xing)”則是生(sheng)(sheng)(sheng)物類似(si)藥(yao)(yao)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)商仿制的生(sheng)(sheng)(sheng)物藥(yao)(yao)與原(yuan)研藥(yao)(yao)生(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)商制造的參(can)考品相(xiang)比(bi)(bi)較而言的。

　　根據ICH的定義(yi)，“可比(bi)性”概念是(shi)不可用于生物(wu)類似藥的。但事實上，“可比(bi)性”和“?