01檢驗方(fang)法驗證(zheng)的基本內容

　　檢(jian)驗方(fang)法驗證的(de)基本內容包括方(fang)案(an)的(de)起草及審批，檢(jian)測儀器的(de)確認。

　　適用性(xing)(xing)驗(yan)(yan)證(包(bao)括準(zhun)確度試驗(yan)(yan)、精密度測定、線性(xing)(xing)范圍試驗(yan)(yan)、專屬性(xing)(xing)試驗(yan)(yan)等)和(he)結果評價及批準(zhun)四個的(de)方(fang)面。

　　02檢驗方法(fa)驗證的基本步驟

　　首先(xian)是(shi)制定驗(yan)證方(fang)案，然(ran)后(hou)對(dui)大型精密儀器進行確(que)認，最關鍵的一步是(shi)檢驗(yan)方(fang)法的適用性試驗(yan)，最后(hou)是(shi)檢驗(yan)方(fang)法評價(jia)及批準。

　　1、驗證方案的制定

　　檢驗(yan)方(fang)法的(de)驗(yan)證方(fang)案通常由質(zhi)量(liang)驗(yan)證小組提(ti)出(chu)。根據(ju)產品(pin)的(de)工藝條件、原輔(fu)料化(hua)學結(jie)構、中(zhong)間體、分解(jie)產物查閱(yue)有關資料，提(ti)出(chu)規格標準，確定(ding)檢查項目，規定(ding)雜質(zhi)限度，即為質(zhi)量(liang)標準草案。

　　根據(ju)質量標準草案確(que)定(ding)檢查(cha)和(he)試驗范圍，對檢驗方(fang)法擬定(ding)具體操作步驟，最后經有關人員(yuan)審批方(fang)可實(shi)施(shi)。

　　2、大型精密儀器的確認

　　分析測試中所(suo)用的檢測儀器(qi)一般可分為三類：

　　A、普(pu)通儀(yi)器(qi)：崩解(jie)儀(yi)，折光儀(yi)、分析天(tian)平、酸度計、溶(rong)點(dian)測定儀(yi)、電導儀(yi)等(deng);

　　B、較(jiao)精密(mi)儀(yi)(yi)器(qi)：旋光儀(yi)(yi)、永(yong)停滴定儀(yi)(yi)、費(fei)休(xiu)氏水分測定儀(yi)(yi)、 自動滴定儀(yi)(yi)、藥物溶出度儀(yi)(yi)、可見分光光度計、電泳儀(yi)(yi)等;

　　C、大型精密(mi)儀器：紫外分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)、紅外分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)、氣相(xiang)色譜儀、高(gao)效液相(xiang)色譜儀、薄層掃描(miao)儀等。

　　為了(le)保證分(fen)析測(ce)試數據準確可靠，每(mei)臺(tai)檢測(ce)儀器(qi)在(zai)投入正(zheng)式使用之(zhi)前都應進(jin)行(xing)確認。

　　檢(jian)測儀(yi)器的確認是檢(jian)驗(yan)方法驗(yan)證(zheng)的基礎，應在(zai)其(qi)它驗(yan)證(zheng)試驗(yan)開始之前首先完成。

　　檢測儀器確認(ren)(ren)工作內容應根據儀器類(lei)型。技術性(xing)(xing)能而定，通(tong)常包括：安(an)裝確認(ren)(ren)、校正(zheng)、適用(yong)性(xing)(xing)預試驗和(he)再確認(ren)(ren)。

　　3、校正

　　校(xiao)正(zheng)是儀器確(que)認及(ji)檢(jian)驗(yan)(yan)方法驗(yan)(yan)證中(zhong)的一(yi)個重要環(huan)節(jie)，應當在驗(yan)(yan)證試驗(yan)(yan)以前(qian)進行校(xiao)正(zheng)。紫外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計校(xiao)正(zheng)包括波長校(xiao)正(zheng)、吸收度(du)測試、準確(que)度(du)測試、雜(za)散光(guang)檢(jian)查。

　　氣相色(se)譜(pu)儀(yi)(yi)與高效液(ye)相色(se)譜(pu)儀(yi)(yi)均要求(qiu)做系統(tong)適用性試驗。在(zai)規定的色(se)譜(pu)條(tiao)件下測(ce)定色(se)譜(pu)柱的最(zui)小理論塔板(ban)數(shu)。分離度(du)和(he)拖尾(wei)因子，并規定變異系數(shu)應(ying)不大于2%。

　　對于(yu)化(hua)學(xue)檢驗(yan)中(zhong)使用(yong)的計量儀器(qi)包括(kuo)容量瓶、移液(ye)管、滴定管、分析天平亦均(jun)應(ying)校正。

　　4、適用性預試驗

　　儀(yi)器的安裝確(que)(que)認完(wan)成以后，在其功能試(shi)驗符合(he)要求(qiu)的情況下，應(ying)用標準(zhun)品或對照品對其進行適(shi)用性檢查，以確(que)(que)認儀(yi)器是(shi)否符合(he)使用要求(qiu)。

　　例如(ru)對熔點(dian)測(ce)定儀的適用(yong)(yong)性預試(shi)(shi)驗是采用(yong)(yong)已知溶點(dian)的甲硝唑(zuo)做試(shi)(shi)驗，測(ce)試(shi)(shi)結果(guo)與已知熔點(dian)比較。

　　紫外(wai)分光光度計可用(yong)已知含量的某(mou)標準品試(shi)驗，測得結果與已知數值(zhi)對(dui)比，確(que)定(ding)儀器是否(fou)符合使用(yong)要(yao)求(qiu)。

　　在完成上述(shu)各項(xiang)試(shi)驗工作的(de)同時(shi)，應(ying)(ying)做好(hao)相應(ying)(ying)的(de)文件記錄等資(zi)料歸檔工作，每一(yi)臺儀器(qi)均應(ying)(ying)有一(yi)套完整(zheng)的(de)檔案(an)資(zi)料。

　　5、再確認

　　為了確保(bao)儀器(qi)處(chu)于(yu)良好的(de)使用狀態(tai)，對于(yu)一臺新購買的(de)儀器(qi)在確認工作結束以(yi)后，應根(gen)據儀器(qi)的(de)類別。確認的(de)經驗制定再確認的(de)計劃(hua)。

　　再確認的時間間隔(ge)和內容要根據儀器類別和使用情況(kuang)決定，一般是(shi)3個月、6個月或1年。

　　儀器再確認的內容通(tong)常包括線路連接、附件(jian)備品消耗(hao)檢(jian)查、清(qing)潔工作、功能試驗、工作日記(ji)等(deng)，其(qi)中重點安裝(zhuang)確認中的功能試驗。

　　03檢(jian)驗方法的(de)適用性驗證

　　藥(yao)品質量標準分析方法(fa)驗證的目(mu)的是證明采用(yong)的方法(fa)適(shi)合于相應的檢測要求。

　　在起草藥(yao)品質量標準時，分(fen)析(xi)方法(fa)需(xu)經(jing)驗(yan)證(zheng)(zheng)：在藥(yao)物生產方法(fa)變更(geng)(geng)、制劑的組分(fen)變更(geng)(geng)、原分(fen)析(xi)方法(fa)進(jin)行(xing)修訂時，則(ze)質量標準分(fen)析(xi)方法(fa)也需(xu)進(jin)行(xing)驗(yan)證(zheng)(zheng)。

　　方法驗證(zheng)過程和結(jie)果均(jun)應記載在(zai)藥品標準起草或修訂(ding)說明中(zhong)。

　　根據《中國藥典》 (2010版)附錄XIXA的原則要(yao)求(qiu)，檢(jian)驗方(fang)法的驗證可分為三種情況處(chu)理;

　　1、無需驗證(zheng)的方(fang)法。如藥典(包括USP、EP、CP、JP等各國(guo)藥典)的方(fang)法，一般只做系統適用性(xing)試驗，以確認系統是(shi)否符合要求(主要指(zhi)儀器穩定性(xing)及柱的分離(li)度是(shi)否達標)。

　　2、對比(bi)法(fa)。已在參(can)(can)比(bi)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)驗(yan)(yan)證(zheng)過的分析方(fang)法(fa)，可用對比(bi)試驗(yan)(yan)的方(fang)法(fa)來確認方(fang)法(fa)的可靠性(xing)，即將本(ben)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)與參(can)(can)比(bi)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)用同(tong)一方(fang)法(fa)對同(tong)批樣品(pin)所測(ce)(ce)數據(ju)進行比(bi)較(如至少(shao)取五(wu)個批號，每批重復測(ce)(ce)定五(wu)次)，判斷(duan)方(fang)法(fa)在本(ben)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)(shi)的可行性(xing)。如有差異需查明原因或設計方(fang)案，對方(fang)法(fa)進行再驗(yan)(yan)證(zheng)。

　　3、需進行系統驗證的方法。

　　04檢驗方法的評價及批準

　　安(an)裝(zhuang)確(que)認(ren)及適用(yong)性(xing)試驗(yan)結(jie)束后，應將試驗(yan)數據資料進(jin)行匯總分析。對檢驗(yan)方法(fa)作出正確(que)的評價，驗(yan)證(zheng)報告的說明(ming)及結(jie)論部(bu)分應簡(jian)明(ming)扼要。

　　試驗(yan)(yan)中的(de)主要(yao)偏差應有適(shi)當解(jie)釋。然后，報主管領(ling)導審(shen)批(pi)(pi)。檢驗(yan)(yan)方(fang)法驗(yan)(yan)證(zheng)的(de)最(zui)終(zhong)產(chan)物是一個經過驗(yan)(yan)證(zheng)的(de)方(fang)法—根據驗(yan)(yan)證(zheng)的(de)結果制訂(ding)的(de)由有關領(ling)導批(pi)(pi)準的(de)檢驗(yan)(yan)方(fang)法。

　　05如何詳細計算檢出限

　　在(zai)如(ru)何正確(que)或準確(que)地估算(suan)檢(jian)出限的(de)問題(ti)上,國際分析(xi)界一(yi)直存有爭議。檢(jian)出限的(de)特殊(shu)意義在(zai)于(yu)可以對一(yi)個(ge)給定(ding)(ding)的(de)分析(xi)方法在(zai)低濃度(du)(du)水平的(de)檢(jian)測(ce)能(neng)力進(jin)行準確(que)地評估，而考察一(yi)個(ge)分析(xi)方法在(zai)低濃度(du)(du)范(fan)圍的(de)檢(jian)測(ce)性能(neng)，可以基于(yu)不同的(de)角(jiao)度(du)(du)或不同的(de)側重(zhong)點(dian),如(ru)可以從最(zui)小信(xin)號(hao)值與儀(yi)器噪音之(zhi)比來考察，從方法測(ce)定(ding)(ding)空(kong)白(bai)的(de)平均(jun)波動(dong)性來統計估算(suan),也可以根據分析(xi)方法校準曲線(xian)的(de)偏差特性來定(ding)(ding)量估算(suan)等等。

　　檢(jian)出(chu)限是評(ping)價一個分析方法(fa)及測(ce)試儀器性能的(de)重要指標,所謂“檢(jian)出(chu)”是指定性檢(jian)出(chu)，即判定樣品中存在有濃(nong)度高于空白的(de)待測(ce)物質(zhi)。

　　ACS(美國化學學會(hui))對這(zhe)一(yi)定義作了更簡(jian)明的概括:檢出(chu)(chu)限是一(yi)個(ge)分析(xi)方法能夠可靠地檢測出(chu)(chu)被(bei)分析(xi)物的最低濃度。

　　1、檢(jian)測限(xian)(limit of detection, LOD)定義:

　　在樣品中能檢出的(de)(de)被(bei)測(ce)組(zu)分的(de)(de)最低(di)濃(nong)度(量)稱為(wei)(wei)檢測(ce)限，即產生信(xin)(xin)號(峰高)為(wei)(wei)基(ji)線噪(zao)(zao)音標(biao)準(zhun)差k倍(bei)時的(de)(de)樣品濃(nong)度，一般為(wei)(wei)信(xin)(xin)噪(zao)(zao)比(S/N)2:1或3:1時的(de)(de)濃(nong)度，對其測(ce)定(ding)的(de)(de)準(zhun)確(que)度和精密度沒(mei)有確(que)定(ding)的(de)(de)要求。目前，一般將檢測(ce)限定(ding)義(yi)為(wei)(wei)信(xin)(xin)噪(zao)(zao)比(S/N)3:1時的(de)(de)濃(nong)度。

　　2、計(ji)算(suan)公式為：

　　D=3N/S (1)

　　式中：N——噪音; S——檢測(ce)器靈(ling)敏(min)度;D——檢測(ce)限

　　將(jiang)式(1)和(he)式(2)合并，得到下式：D=3N×Q/I (3)

　　式中：Q——進樣量;N——噪音;I——信(xin)(xin)號(hao)響應(ying)值。I/N即(ji)為該進樣量下(xia)的(de)信(xin)(xin)噪比(bi)(S/N)，該信(xin)(xin)噪比(bi)可通過(guo)工(gong)作站對圖譜(pu)進行(xing)自動(dong)分析獲得(de)，一般的(de)色譜(pu)或質譜(pu)工(gong)作站都(dou)可進行(xing)信(xin)(xin)噪比(bi)分析計算(suan)。這(zhe)樣檢測(ce)限的(de)計算(suan)方法就變得(de)非常方便(bian)了。

　　3、計算方法：

　　實(shi)際(ji)計算時，檢(jian)(jian)出限(xian)有2種(zhong)(zhong)表示(shi)方法：一種(zhong)(zhong)是進(jin)樣(yang)瓶中樣(yang)品(pin)檢(jian)(jian)測限(xian)，一種(zhong)(zhong)是針對原始樣(yang)品(pin)的(de)方法檢(jian)(jian)出限(xian)。

　　A、對(dui)第(di)一種檢(jian)測(ce)限(xian)，只要知道進(jin)樣(yang)(yang)量和信噪比即可計算。如進(jin)樣(yang)(yang)瓶中樣(yang)(yang)品濃度為(wei)1 mg/L,在此(ci)濃度下的信噪比為(wei)300(由(you)工作(zuo)站分析獲(huo)得)，則其(qi)檢(jian)測(ce)限(xian)為(wei)：D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也可用(yong)絕對(dui)進(jin)樣(yang)(yang)量表示，若進(jin)樣(yang)(yang)體積為(wei)10 uL，則其(qi)檢(jian)測(ce)限(xian)為(wei)：D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。

　　B、對第(di)二種表(biao)示方(fang)法，需同(tong)時(shi)考慮原(yuan)始樣品(pin)的取(qu)樣量(liang)和提取(qu)樣品(pin)的定(ding)容體(ti)積。仍按(an)前述樣品(pin)計算，若取(qu)樣量(liang)為(wei)(wei)5克，最后定(ding)容體(ti)積為(wei)(wei)5 mL，則方(fang)法檢測限(xian)為(wei)(wei)：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

　　即當原始樣(yang)品中(zhong)(zhong)待檢物質(zhi)的(de)(de)濃度為0.01mg/kg時，若取樣(yang)量(liang)為5g,樣(yang)品經前處理后定(ding)容(rong)體積為5mL時,進樣(yang)瓶中(zhong)(zhong)樣(yang)品的(de)(de)濃度可達0.01mg/L(假定(ding)回收率(lv)為100%),此時，在其它給定(ding)的(de)(de)分析條件下，能產生3倍噪聲強度的(de)(de)信號。在實際檢測工作中(zhong)(zhong)，第二種表示方法更為常見。

　　4、注意事項

　　由式(3)可(ke)見(jian)，信(xin)噪比的(de)大(da)小(xiao)直接關系到檢測限(xian)的(de)大(da)小(xiao)。信(xin)噪比計算(suan)方(fang)(fang)法的(de)不同，其比值大(da)小(xiao)有很(hen)大(da)不同，這與計算(suan)信(xin)噪比時基線噪聲峰(feng)值的(de)定義方(fang)(fang)式有關，一般有三種(zhong)不同的(de)定義：

　　A、峰/峰(peak to peak)信噪比，用(yong)某一段基線噪聲(sheng)的平均高度;

　　B、峰(feng)/半峰(feng)(half peak to peak)信噪比, 用某(mou)一(yi)段基線噪聲平均高度的(de)1/2;

　　C、均方(fang)根(gen)(RMS)信噪比(bi)，用某一段基線噪聲的均方(fang)根(gen)值計算。

　　除此之(zhi)外，信噪(zao)比的(de)計算(suan)結果(guo)還和所取噪(zao)聲的(de)位(wei)置(zhi)有(you)很大關系，取信號哪(na)一(yi)側(ce)基(ji)(ji)線的(de)噪(zao)聲，取多長一(yi)段基(ji)(ji)線上的(de)噪(zao)聲，計算(suan)結果(guo)都很不完全相(xiang)同，有(you)時(shi)相(xiang)差甚(shen)遠。一(yi)般多取樣品峰(feng)兩側(ce)的(de)噪(zao)聲峰(feng)值計算(suan)。

　　5、檢出(chu)限(xian)的確定

　　A、《全球環境監測系統水監測操作指南》中規定：給定置信(xin)水平為95%時，樣(yang)品測定值與零濃度(du)樣(yang)品的(de)測定值有顯(xian)著(zhu)性差異即為檢出限：

　　L = 4.6Sb式中(zhong)：

　　L——方(fang)法的最低檢出濃(nong)度(du)。

　　Sb ——測定次(ci)數為n次(ci)的空白平(ping)行測定(批內)標準(zhun)差(重復(fu)測定20次(ci)以(yi)上)。

　　B、國際純粹(cui)和(he)應(ying)用化學(xue)聯(lian)合會(IUPAC)規定對各種光學(xue)分析方(fang)法，可用下式計算：

　　L = KSb/S

　　L——方(fang)法的最低(di)檢出濃度

　　Sb——空(kong)白多(duo)次測量(liang)的標準偏差(cha)(吸光度);

　　S ——方(fang)法(fa)的(de)(de)靈敏度(即(ji)校準曲(qu)線(xian)的(de)(de)斜(xie)率(lv))

　　為了評估(gu) ，空白測(ce)定(ding)次數必(bi)須(xu)足夠多，最好能測(ce)20次。國際純粹和應用(yong)化學聯合會極(ji)力(li)提倡取k值為3，一般(ban)來說，取 相應的置信(xin)水平大約為90%。

　　若 =0，并(bing)不(bu)意(yi)味著 ，或檢(jian)出(chu)限無限小。這時需配制一個濃度(du)略大于零濃度(du)的試樣系列(lie)(能產生(sheng)一個可測信號(hao)值)代(dai)替全(quan)程序空白試驗，求(qiu)出(chu)其標準偏差(cha)，用來代(dai)替 。

　　此外，有時為(wei)(wei)(wei)了工作方便和(he)便于比較，也規定一個大家(jia)能(neng)接受(shou)的信號值作為(wei)(wei)(wei)檢(jian)出限(xian)，如分光(guang)光(guang)度法中(zhong)，規定吸光(guang)度為(wei)(wei)(wei)0.010所對應的濃度即為(wei)(wei)(wei)檢(jian)出限(xian)L。

　　C、 美(mei)國EPA SW—846規定(ding)方(fang)法中的檢(jian)出限為：

　　L=3.143Sb

　　D、某些分光(guang)光(guang)度法是以(yi)吸光(guang)度(扣除空白)為0.010相對應(ying)的濃度值(zhi)或絕(jue)對量為檢(jian)出限(xian)，這(zhe)是一種實(shi)驗室間的協定(ding)方案。

　　E、氣相色(se)譜(pu)法(fa)：檢測器恰能產生(sheng)與(yu)噪音相區別的響(xiang)應(ying)信號時所需進入色(se)譜(pu)的物質最小量(liang)為檢出(chu)限，一般(ban)為噪音的二倍。

　　F、離子選擇電(dian)極(ji)法：當校準曲線(xian)(xian)的直(zhi)線(xian)(xian)部分(fen)外延的延長(chang)線(xian)(xian)與(yu)通過空白(bai)電(dian)位且平行于濃(nong)度軸的直(zhi)線(xian)(xian)相交(jiao)時，其(qi)交(jiao)點(dian)所(suo)(suo)對應的濃(nong)度值即(ji)為該離子色(se)譜所(suo)(suo)對電(dian)極(ji)法的檢(jian)出限(xian)。

　　由(you)測(ce)得的(de)空白值(zhi)(zhi)計(ji)算出的(de)L值(zhi)(zhi)不應(ying)大于分析方法規(gui)定的(de)最低(di)(di)檢出濃度值(zhi)(zhi)，如大于方法規(gui)定值(zhi)(zhi)時，必(bi)須尋找原因降低(di)(di)空白值(zhi)(zhi)，重新測(ce)定計(ji)算至(zhi)合(he)格。

　　6、校正曲線繪制：

　　A、按分析(xi)方法(fa)(fa)步驟，通過實(shi)測(ce)濃度和儀器信號值的直(zhi)線關系，確(que)定(ding)實(shi)驗室條件下的測(ce)定(ding)上(shang)限(xian)。當測(ce)定(ding)上(shang)限(xian)低于(yu)方法(fa)(fa)的檢(jian)測(ce)上(shang)限(xian)時，只能用實(shi)測(ce)的直(zhi)線范圍。

　　B、繪(hui)制校(xiao)正曲線的(de)分(fen)析步驟應與樣品分(fen)析相同，并(bing)且不少(shao)于5個濃度值。

　　C、校正(zheng)曲線(xian)繪制與每批測定(ding)樣(yang)品同(tong)時進(jin)行，對某些分析(xi)方法的(de)校正(zheng)曲線(xian)的(de)斜率穩定(ding)，批間誤差較小(xiao)，使用(yong)原(yuan)制校正(zheng)曲線(xian)時，應(ying)與樣(yang)品同(tong)時測定(ding)2份(fen)中(zhong)等濃度(du)標(biao)樣(yang)和2份(fen)空(kong)白的(de)平行樣(yang)。

　　測得(de)標準的濃度(du)(減去空白)值與(yu)原(yuan)校正曲線相對應的濃度(du)值的相對偏(pian)差，分光(guang)光(guang)度(du)應小于(yu)5%;原(yuan)子吸(xi)收法應小于(yu)10%，否(fou)則重新制作校正曲線。

　　06小結

　　最(zui)后還(huan)要特(te)別強調，檢出(chu)限(xian)和(he)(he)測定(ding)下(xia)限(xian)是兩個(ge)(ge)不同的(de)(de)概念，它們是評價一個(ge)(ge)分析(xi)方法(fa)及測試儀(yi)器性(xing)(xing)能的(de)(de)重(zhong)要指標，檢出(chu)限(xian)是一個(ge)(ge)定(ding)性(xing)(xing)概念，而測定(ding)下(xia)限(xian)是一個(ge)(ge)定(ding)量概念，搞清楚兩者概念和(he)(he)相互(hu)關系，可提高色譜分析(xi)中(zhong)檢測結果的(de)(de)準確(que)性(xing)(xing)和(he)(he)可靠(kao)性(xing)(xing)，特(te)別在(zai)痕量分析(xi)中(zhong)，檢出(chu)限(xian)和(he)(he)測定(ding)下(xia)限(xian)的(de)(de)確(que)定(ding)對(dui)于(yu)分析(xi)方法(fa)的(de)(de)選擇(ze)具有重(zhong)要意義(yi)，同樣的(de)(de)，對(dui)于(yu)實驗室質量控(kong)制也具有很重(zhong)要的(de)(de)意義(yi)。