檢驗方法驗證的基本內容包括方案的起草及審批，檢測儀器的確認。

適用(yong)性(xing)(xing)驗(yan)證（包括準(zhun)確度試(shi)驗(yan)、精密度測定(ding)、線(xian)性(xing)(xing)范圍試(shi)驗(yan)、專屬性(xing)(xing)試(shi)驗(yan)等(deng)）和(he)結果評價及批(pi)準(zhun)四個(ge)的方面。

首(shou)先是制定驗(yan)證方(fang)案，然后對大型精(jing)密(mi)儀器進行確認，最關鍵(jian)的一步是檢驗(yan)方(fang)法(fa)的適用性試驗(yan)，最后是檢驗(yan)方(fang)法(fa)評價及批準。

1、驗(yan)證(zheng)方案的制定

檢驗方法的驗證方案(an)通(tong)常由(you)質(zhi)量(liang)(liang)驗證小組提出。根(gen)據產品的工藝條件、原輔料化學結(jie)構、中間體、分(fen)解產物查閱(yue)有(you)關(guan)資(zi)料，提出規格標準，確定(ding)檢查項目(mu)，規定(ding)雜質(zhi)限度，即為質(zhi)量(liang)(liang)標準草案(an)。

根據(ju)質量標準草案(an)確定檢(jian)查和試驗范圍，對檢(jian)驗方法(fa)擬定具體操作步驟，最后(hou)經有關人員審批方可實(shi)施。

2、大型精密儀器的確認(ren)

分(fen)析測試中(zhong)所用的檢測儀(yi)器(qi)一般可(ke)分(fen)為三類：

A、普通儀(yi)(yi)器：崩(beng)解儀(yi)(yi)，折光儀(yi)(yi)、分析天平(ping)、酸度計、溶點(dian)測定儀(yi)(yi)、電導(dao)儀(yi)(yi)等(deng);

B、較精密(mi)儀器：旋光儀、永停滴定(ding)儀、費(fei)休氏水(shui)分(fen)測定(ding)儀、 自動滴定(ding)儀、藥物(wu)溶出度(du)儀、可見(jian)分(fen)光光度(du)計(ji)、電泳儀等(deng)；

C、大型精密儀(yi)器：紫外(wai)分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、紅外(wai)分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、氣(qi)相(xiang)色(se)譜儀(yi)、高效液相(xiang)色(se)譜儀(yi)、薄層掃描(miao)儀(yi)等。

為了保(bao)證(zheng)分析測試(shi)數據準確(que)(que)可靠(kao)，每臺檢測儀器在投入正(zheng)式使用之前都應進行(xing)確(que)(que)認。

檢測儀(yi)器的確認(ren)是檢驗(yan)方法驗(yan)證(zheng)的基礎，應在其它驗(yan)證(zheng)試驗(yan)開始之前首先完成。

檢(jian)測儀器確(que)認(ren)工作內容應根據儀器類型。技術(shu)性能而(er)定(ding)，通常包括：安裝確(que)認(ren)、校正、適用性預試驗和再確(que)認(ren)。

3、校正

校正(zheng)(zheng)是儀器確(que)認及檢(jian)驗(yan)方法(fa)驗(yan)證中的一個重要環節(jie)，應當在(zai)驗(yan)證試(shi)驗(yan)以前進行校正(zheng)(zheng)。紫外(wai)分(fen)光光度計校正(zheng)(zheng)包(bao)括波長校正(zheng)(zheng)、吸收度測試(shi)、準確(que)度測試(shi)、雜散光檢(jian)查。

氣相(xiang)色譜(pu)儀(yi)(yi)與高效(xiao)液(ye)相(xiang)色譜(pu)儀(yi)(yi)均要(yao)求做系(xi)統適用性試(shi)驗。在規(gui)定(ding)的(de)色譜(pu)條件(jian)下測(ce)定(ding)色譜(pu)柱(zhu)的(de)最小(xiao)理論塔板數(shu)(shu)。分離度和拖尾因子，并規(gui)定(ding)變異(yi)系(xi)數(shu)(shu)應不大于2％。

對于(yu)化(hua)學(xue)檢驗(yan)中使用的計量(liang)儀器包括容量(liang)瓶、移(yi)液管、滴定管、分析(xi)天(tian)平亦均應(ying)校(xiao)正。

4、適用性(xing)預試驗(yan)

儀(yi)器的(de)安(an)裝確認(ren)完成以后，在其功能試驗(yan)符合要求的(de)情(qing)況下(xia)，應用標準(zhun)品或(huo)對(dui)照品對(dui)其進(jin)行適(shi)用性檢查，以確認(ren)儀(yi)器是否符合使(shi)用要求。

例(li)如對熔點(dian)測(ce)(ce)定儀的適用性預試驗(yan)(yan)是采用已知(zhi)溶點(dian)的甲硝唑做(zuo)試驗(yan)(yan)，測(ce)(ce)試結果(guo)與(yu)已知(zhi)熔點(dian)比較。

紫(zi)外(wai)分(fen)光光度計可(ke)用已知含(han)量(liang)的某標(biao)準品(pin)試驗，測得結果與已知數值對比，確定儀(yi)器是否符合使用要求。

在完成上(shang)述各項(xiang)試驗工(gong)作的同時(shi)，應(ying)做(zuo)好(hao)相(xiang)應(ying)的文件記錄等(deng)資料(liao)(liao)歸檔工(gong)作，每一臺儀器均(jun)應(ying)有一套完整的檔案(an)資料(liao)(liao)。

5、再確(que)認

為了確保儀器處于良(liang)好(hao)的使用狀(zhuang)態，對于一(yi)臺新購買的儀器在(zai)確認工作結束以后，應根據儀器的類(lei)別。確認的經驗制定再確認的計劃。

再(zai)確認的(de)時間間隔(ge)和內容要根據(ju)儀器類別和使用情況(kuang)決定，一般(ban)是3個月、6個月或1年。

儀器再確認的內(nei)容通常包括(kuo)線路連(lian)接、附件備品(pin)消耗(hao)檢查、清(qing)潔工作、功能試(shi)驗、工作日記等，其中重點安裝確認中的功能試(shi)驗。

藥(yao)品質量標準(zhun)分析方法驗證的(de)目的(de)是(shi)證明采(cai)用(yong)的(de)方法適合于(yu)相應的(de)檢測要求。

在(zai)起(qi)草藥(yao)品質(zhi)量(liang)(liang)標(biao)準(zhun)時，分(fen)(fen)析(xi)方法(fa)需經驗證(zheng)：在(zai)藥(yao)物生產方法(fa)變(bian)更、制劑的組(zu)分(fen)(fen)變(bian)更、原分(fen)(fen)析(xi)方法(fa)進行修(xiu)訂時，則質(zhi)量(liang)(liang)標(biao)準(zhun)分(fen)(fen)析(xi)方法(fa)也需進行驗證(zheng)。

方法驗證過程和結(jie)果均(jun)應記載(zai)在藥品標準起草或修訂說明中。

根據《中國(guo)藥(yao)典》 附錄XIXA的原(yuan)則要求，檢驗方法(fa)的驗證可分為三種情況處理；

1、無需驗證的(de)方(fang)法。如(ru)藥典(包括(kuo)USP、EP、CP、JP等(deng)各國藥典)的(de)方(fang)法，一(yi)般只(zhi)做系(xi)統(tong)適用性試驗，以確認系(xi)統(tong)是否符合(he)要求(主要指(zhi)儀器(qi)穩(wen)定性及柱的(de)分離度是否達標)。

2、對(dui)比法(fa)(fa)。已在參比實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)驗(yan)(yan)(yan)證(zheng)過的分析方(fang)(fang)法(fa)(fa)，可用對(dui)比試驗(yan)(yan)(yan)的方(fang)(fang)法(fa)(fa)來確認(ren)方(fang)(fang)法(fa)(fa)的可靠性，即將(jiang)本實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)與參比實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)用同(tong)一方(fang)(fang)法(fa)(fa)對(dui)同(tong)批(pi)樣(yang)品(pin)所測(ce)數據進行(xing)比較(如至少(shao)取五個批(pi)號(hao)，每批(pi)重復測(ce)定五次(ci))，判斷方(fang)(fang)法(fa)(fa)在本實(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)室(shi)的可行(xing)性。

如有差異需查明原因或(huo)設計方案，對方法進行再(zai)驗證。

3、需(xu)進行系(xi)統(tong)驗證的方法(fa)。

安裝確認及適用(yong)性試驗結束后，應(ying)將試驗數據資料進行(xing)匯總分析(xi)。對檢驗方(fang)法作(zuo)出正確的(de)評價，驗證報告的(de)說明及結論部(bu)分應(ying)簡明扼(e)要。

試驗(yan)中的(de)主(zhu)要偏差應有適(shi)當解(jie)釋。然(ran)后，報主(zhu)管領導審批。檢驗(yan)方(fang)(fang)法驗(yan)證(zheng)的(de)最終產物是(shi)一個經過(guo)驗(yan)證(zheng)的(de)方(fang)(fang)法—根據(ju)驗(yan)證(zheng)的(de)結果(guo)制訂的(de)由有關領導批準的(de)檢驗(yan)方(fang)(fang)法。

在如何正確(que)或準確(que)地(di)估(gu)算檢出限(xian)的(de)(de)問題上,國(guo)際(ji)分析界一直(zhi)存有爭議。檢出限(xian)的(de)(de)特殊意義在于可以(yi)對一個(ge)給(gei)定(ding)的(de)(de)分析方(fang)法在低(di)濃度水平的(de)(de)檢測能力進行(xing)準確(que)地(di)評估(gu)，而考(kao)察(cha)(cha)一個(ge)分析方(fang)法在低(di)濃度范圍的(de)(de)檢測性(xing)能，可以(yi)基于不同的(de)(de)角度或不同的(de)(de)側重(zhong)點,如可以(yi)從最小信號值與儀器噪音(yin)之比(bi)來考(kao)察(cha)(cha)，從方(fang)法測定(ding)空白的(de)(de)平均(jun)波動性(xing)來統計估(gu)算,也可以(yi)根據分析方(fang)法校(xiao)準曲線的(de)(de)偏差特性(xing)來定(ding)量(liang)估(gu)算等等。

檢出(chu)限是評(ping)價一個分析(xi)方法及(ji)測試儀器性(xing)能(neng)的重要指標,所謂“檢出(chu)”是指定性(xing)檢出(chu)，即(ji)判定樣品中存(cun)在有濃度(du)高于(yu)空白的待測物質。

ACS(美國化學學會)對這一定義作了更簡明的概括:檢出限是一個(ge)分(fen)析(xi)方法(fa)能夠可靠地檢測出被(bei)分(fen)析(xi)物的最低濃度。

1、檢測限（limit of detection, LOD）定義(yi):

在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度（量）稱為檢測限，即產生信號（峰高）為基線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時的濃度，對其測定的準確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測限定義為信噪比（S/N）3:1時的濃度。

2、計算公(gong)式為：

D=3N/S （1）

式中(zhong)：N——噪音; S——檢測(ce)器靈敏度；D——檢測(ce)限

而(er)靈敏度的計(ji)算(suan)公式為：

S=I/Q （2）

式(shi)中：S——靈敏度；I——信(xin)號響應值；Q——進樣量(liang)

將(jiang)式（1）和式（2）合并，得到下(xia)式：

D=3N×Q/I (3)

式中(zhong)：Q——進樣量；N——噪音(yin)；I——信號響(xiang)應(ying)值(zhi)。I/N即(ji)為該進樣量下的(de)信噪比（S/N），該信噪比可(ke)通過工(gong)作站對(dui)圖譜進行(xing)自動分(fen)析獲得(de)，一般的(de)色譜或(huo)質譜工(gong)作站都可(ke)進行(xing)信噪比分(fen)析計算(suan)。這樣檢測(ce)限(xian)的(de)計算(suan)方法就變(bian)得(de)非常方便了。

3、計算方法(fa)：

實際計算時，檢出限有2種表示方法：一種是進樣瓶中樣品檢測限，一種是針對原始樣品的方法檢出限。

A、對第一種檢(jian)測限，只要知道進(jin)樣(yang)量和信噪(zao)比即可計算。如進(jin)樣(yang)瓶(ping)中樣(yang)品濃度為(wei)1 mg/L,在此濃度下的信噪(zao)比為(wei)300(由工作站分析獲得(de))，則其檢(jian)測限為(wei)：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也可用絕對進(jin)樣(yang)量表示(shi)，若進(jin)樣(yang)體積為(wei)10 ul，則其檢(jian)測限為(wei)：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。

B、對第二種表(biao)示方法，需(xu)同時考慮原始樣品的(de)取(qu)樣量(liang)和(he)提取(qu)樣品的(de)定容(rong)體積。仍按前述樣品計算，若取(qu)樣量(liang)為5克，最后定容(rong)體積為5 mL，則(ze)方法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

即當原始樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)待檢(jian)物質(zhi)的(de)濃度為0.01mg/kg時，若(ruo)取(qu)樣(yang)(yang)量為5g,樣(yang)(yang)品(pin)經前處理后(hou)定(ding)容體(ti)積為5mL時,進樣(yang)(yang)瓶中(zhong)樣(yang)(yang)品(pin)的(de)濃度可達0.01mg/L（假定(ding)回收率為100%）,此(ci)時，在(zai)其它給定(ding)的(de)分(fen)析條件下，能產生3倍噪聲強度的(de)信(xin)號。在(zai)實際檢(jian)測工(gong)作中(zhong)，第(di)二種表示方法更(geng)為常見。

4、注意事項

由式（3）可見，信噪比的大小直接關系到檢測限的大小。信噪比計算方法的不同，其比值大小有很大不同，這與計算信噪比時基線噪聲峰值的定義方式有關，一般有三種不同的定義：

A、峰/峰（peak to peak）信噪比，用某一段(duan)基線噪聲的平均高度；

B、峰/半峰（half peak to peak）信(xin)噪比, 用某一(yi)段基線噪聲平均高度的(de)1/2；

C、均(jun)(jun)方根（RMS）信(xin)噪(zao)比，用(yong)某一(yi)段基線噪(zao)聲的均(jun)(jun)方根值計算。

除此(ci)之外(wai)，信噪(zao)比的計算結果(guo)還和所取(qu)噪(zao)聲的位置有很大關系，取(qu)信號哪一側基線(xian)的噪(zao)聲，取(qu)多(duo)長(chang)一段基線(xian)上的噪(zao)聲，計算結果(guo)都很不完(wan)全相同，有時(shi)相差甚遠。一般多(duo)取(qu)樣品峰兩(liang)側的噪(zao)聲峰值計算。

5、檢出限的確定(ding)

A、《全球(qiu)環境監測(ce)系(xi)統(tong)水(shui)監測(ce)操作指南》中規定(ding)：給定(ding)置信水(shui)平為95%時，樣(yang)品測(ce)定(ding)值與(yu)零濃度樣(yang)品的測(ce)定(ding)值有顯(xian)著性差異即為檢出限(xian)：

L = 4.6Sb

式(shi)中：L——方法的最(zui)低檢出(chu)濃度。

Sb ——測(ce)定次(ci)數為n次(ci)的空白平行測(ce)定（批內）標(biao)準差（重復(fu)測(ce)定20次(ci)以(yi)上）。

B、國(guo)際純粹和應用化學(xue)聯合(he)會（IUPAC）規定對各種光學(xue)分析方法，可用下式(shi)計算：

L = KSb/S

L——方法(fa)的最(zui)低檢出濃度

Sb——空(kong)白(bai)多(duo)次測量的標(biao)準偏差（吸光度）；

S ——方法(fa)的靈敏(min)度(du)（即校(xiao)準曲線的斜(xie)率(lv)）

為(wei)(wei)了評估 ，空白(bai)測定(ding)次數必須足夠多，最好能(neng)測20次。國(guo)際純粹和應用化(hua)學聯合會極力提倡取(qu)k值為(wei)(wei)3，一(yi)般來說(shuo)，取(qu) 相應的置信水(shui)平大約(yue)為(wei)(wei)90%。

若 =0，并不意味著 ，或檢出限(xian)無限(xian)小。這(zhe)時(shi)需配(pei)制一個濃(nong)度(du)(du)略大于零濃(nong)度(du)(du)的試(shi)樣系列（能產生一個可測信號值(zhi)）代替全程序空白(bai)試(shi)驗，求出其標準(zhun)偏差，用來代替 。

此外(wai)，有時為了(le)工作(zuo)方便和便于比較，也規(gui)定一個(ge)大家能(neng)接受的(de)信號值作(zuo)為檢(jian)出限，如分(fen)光(guang)光(guang)度法中，規(gui)定吸光(guang)度為0.010所對應的(de)濃度即為檢(jian)出限L。

C、 美國EPA SW—846規定方(fang)法(fa)中(zhong)的檢出限為：

L=3.143Sb

D、某些分光光度法(fa)是(shi)以吸光度（扣除空白）為0.010相對應(ying)的濃度值或絕對量(liang)為檢出限，這是(shi)一種實(shi)驗室(shi)間的協定方案。

E、氣相色(se)譜法：檢測器恰能產生與(yu)噪音相區別的(de)(de)響應信號時所需進入(ru)色(se)譜的(de)(de)物質最小(xiao)量為檢出限(xian)，一般為噪音的(de)(de)二倍。

F、離子(zi)選擇電極法：當校準曲線(xian)(xian)的直線(xian)(xian)部分(fen)外延(yan)的延(yan)長(chang)線(xian)(xian)與通過(guo)空白電位(wei)且平行(xing)于濃度軸的直線(xian)(xian)相交(jiao)時，其交(jiao)點所對應(ying)的濃度值即(ji)為該(gai)離子(zi)色譜所對電極法的檢出(chu)限。

由測(ce)得的(de)空白值(zhi)(zhi)計算出的(de)L值(zhi)(zhi)不應大(da)于分析方(fang)法(fa)規定的(de)最低檢出濃度值(zhi)(zhi)，如大(da)于方(fang)法(fa)規定值(zhi)(zhi)時(shi)，必須尋找原因降低空白值(zhi)(zhi)，重新測(ce)定計算至合格。

6、校正曲(qu)線繪制：

A、按分析方法步驟，通過實測濃度和儀器信號值的直線關系，確定實驗室條件下的測定上限。當測定上限低于方法的檢測上限時，只能用實測的直線范圍。

B、繪制(zhi)校正曲線的分(fen)析(xi)步(bu)驟應與樣品分(fen)析(xi)相同，并且(qie)不(bu)少于(yu)5個濃度(du)值。

C、校(xiao)正(zheng)(zheng)曲線繪制與(yu)(yu)每批測定(ding)樣(yang)品同時(shi)(shi)(shi)進行，對某些分析方法(fa)的(de)校(xiao)正(zheng)(zheng)曲線的(de)斜率穩(wen)定(ding)，批間誤差較小，使用原(yuan)制校(xiao)正(zheng)(zheng)曲線時(shi)(shi)(shi)，應與(yu)(yu)樣(yang)品同時(shi)(shi)(shi)測定(ding)2份(fen)中等濃度標(biao)樣(yang)和2份(fen)空(kong)白的(de)平(ping)行樣(yang)。

測得標準的濃度（減(jian)去空白）值與(yu)原校(xiao)正曲線相對(dui)應(ying)的濃度值的相對(dui)偏差(cha)，分光(guang)光(guang)度應(ying)小(xiao)于(yu)5%；原子吸收法應(ying)小(xiao)于(yu)10%，否則重新制作校(xiao)正曲線。

最后還要特別強調，檢出限和測定下限是兩個不同的概念，它們是評價一個分析方法及測試儀器性能的重要指標，檢出限是一個定性概念，而測定下限是一個定量概念，搞清楚兩者概念和相互關系，可提高色譜分析中檢測結果的準確性和可靠性，特別在痕量分析中，檢出限和測定下限的確定對于分析方法的選擇具有重要意義，同樣的，對于實驗室質量控制也具有很重要的意義。