2015年6月17日，“第(di)四屆(jie)中(zhong)國食(shi)品(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)質量安(an)(an)全(quan)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)技(ji)術(shu)(shu)國際論(lun)壇(tan)暨展覽會(hui)(hui)”在北(bei)京(jing)國家會(hui)(hui)議中(zhong)心(xin)開幕。此次會(hui)(hui)議特別設(she)置了“食(shi)品(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)安(an)(an)全(quan)微生物檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)”、“食(shi)品(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)中(zhong)重金屬元素(su)和(he)其他有(you)害物質檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)”、“飲用(yong)水(shui)安(an)(an)全(quan)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)”等九個專題(ti)。大會(hui)(hui)第(di)二天，來自北(bei)京(jing)出入境檢(jian)(jian)驗檢(jian)(jian)疫(yi)局(ju)的(de)曾靜博士在“食(shi)品(pin)(pin)與農產品(pin)(pin)安(an)(an)全(quan)微生物檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)”專題(ti)中(zhong)做了題(ti)為“微生物鑒定技(ji)術(shu)(shu)的(de)發(fa)展歷(li)程(cheng)”的(de)報告(gao)。

專題現場

北京出入境檢驗檢疫局 曾靜博士

　　隨著人(ren)們生(sheng)(sheng)活水平的不(bu)斷提高，食品安全問(wen)題越來越受到人(ren)們的重視，微生(sheng)(sheng)物對(dui)(dui)食品的污染問(wen)題也相應地備受關注。微生(sheng)(sheng)物包括細菌(jun)、真菌(jun)等，有些微生(sheng)(sheng)物還是致病菌(jun)，對(dui)(dui)人(ren)體的危害很大，因此食品中微生(sheng)(sheng)物的檢(jian)測非常重要(yao)。

　　在報(bao)告中(zhong)曾靜介紹，微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)鑒定(ding)技(ji)術在檢驗(yan)檢疫;食品、化妝品等產(chan)品致(zhi)病(bing)菌(jun)的檢測(ce);動物(wu)源性(xing)致(zhi)病(bing)菌(jun)的檢測(ce);植物(wu)病(bing)原細菌(jun)、真菌(jun)的檢測(ce)等工(gong)(gong)作(zuo)中(zhong)起(qi)到非常關鍵的作(zuo)用。檢驗(yan)檢疫工(gong)(gong)作(zuo)中(zhong)的微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)鑒定(ding)工(gong)(gong)作(zuo)主要有(you)判斷該菌(jun)是不是目標的致(zhi)病(bing)菌(jun)和新發現的菌(jun)的種(zhong)類(lei)兩(liang)項內容(rong)。相(xiang)比而言(yan)，后(hou)者需要做更完善的實驗(yan)，參考多種(zhong)方法相(xiang)互印證以(yi)后(hou)才能確定(ding)該菌(jun)的種(zhong)類(lei)。

　　曾靜說，目前微生物鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)術的發展有兩個方向，速度(du)快和分型能(neng)力強。速度(du)快的微生物鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)術主(zhu)要以飛行時間(jian)質譜(MALDI-TOF MS)鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)術為典型代(dai)表(biao)，可以在數十秒(miao)內實現微生物的鑒(jian)(jian)定(ding);分型能(neng)力強的鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)術主(zhu)要包括各種基于DNA的鑒(jian)(jian)定(ding)技(ji)術。

　　在報告中，曾靜(jing)介紹，微(wei)生物(wu)鑒定(ding)技術(shu)主要(yao)有形(xing)態學觀察、全自動微(wei)生物(wu)生化鑒定(ding)系統和依據(ju)細(xi)胞物(wu)質進(jin)行微(wei)生物(wu)鑒定(ding)技術(shu)等(deng)方法。她在報告中對三(san)種(zhong)方法進(jin)行了詳細(xi)的闡述。

　　據(ju)她介紹，微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的形(xing)(xing)(xing)態(tai)學(xue)觀察主(zhu)(zhu)要(yao)是依據(ju)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的形(xing)(xing)(xing)態(tai)和生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)理生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化反應等(deng)特(te)征來(lai)進行微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的分類和鑒定。用微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的形(xing)(xing)(xing)態(tai)特(te)征來(lai)鑒定微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)是由于(yu)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的形(xing)(xing)(xing)態(tai)比較單一(yi)，容易分辨(bian);用微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)的生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)理生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化反應特(te)征來(lai)鑒定微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)主(zhu)(zhu)要(yao)是依據(ju)微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)細胞壁的組成、微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)發酵(jiao)產物(wu)(wu)(wu)和微(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)對碳源、氮源等(deng)養分的利用。

　　曾(ceng)靜同時(shi)提到(dao)這種方法相對比(bi)較(jiao)繁瑣(suo)、耗時(shi)，因此近年(nian)來被全(quan)自(zi)動微生物生化(hua)鑒(jian)定系統逐步替代。

　　她介紹道，全自(zi)(zi)動(dong)(dong)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)鑒(jian)定(ding)系統實際上(shang)是將多個生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)反應(ying)有效整合、濃縮于商(shang)業(ye)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)的(de)板卡(ka)上(shang)，方(fang)便實驗(yan)室進行微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)的(de)鑒(jian)定(ding)。全自(zi)(zi)動(dong)(dong)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)鑒(jian)定(ding)系統具有以下(xia)優點：1.生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)反應(ying)數量多，商(shang)業(ye)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)的(de)卡(ka)板最多可(ke)(ke)集合45-46種生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)反應(ying);2.實驗(yan)操作(zuo)標(biao)準(zhun)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)，節省(sheng)大量人工;3.鑒(jian)定(ding)速度快，一般3-4小時即(ji)可(ke)(ke)出鑒(jian)定(ding)結果。基于以上(shang)優點，目前(qian)，全自(zi)(zi)動(dong)(dong)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)鑒(jian)定(ding)系統已經作(zuo)為實驗(yan)室中微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)的(de)日常鑒(jian)定(ding)手段。除此之外，全自(zi)(zi)動(dong)(dong)微(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)(hua)(hua)鑒(jian)定(ding)系統還具有細菌(jun)的(de)MIC值(zhi)測(ce)定(ding)和耐(nai)藥(yao)表型的(de)檢(jian)測(ce)等作(zuo)用。

　　曾靜在介(jie)紹依據細(xi)胞物質(zhi)(zhi)進行微生(sheng)物鑒(jian)定(ding)(ding)技(ji)術(shu)(shu)時(shi)說(shuo)，該技(ji)術(shu)(shu)主要包括蛋(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)的檢(jian)測(ce)和DNA的檢(jian)測(ce)，是目前微生(sheng)物鑒(jian)定(ding)(ding)技(ji)術(shu)(shu)的兩個發展方向(xiang)。依據蛋(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)檢(jian)測(ce)的鑒(jian)定(ding)(ding)技(ji)術(shu)(shu)，具有鑒(jian)定(ding)(ding)速度快的特點(dian)，主要檢(jian)測(ce)儀器有飛行時(shi)間質(zhi)(zhi)譜(pu)。基(ji)于(yu)DNA檢(jian)測(ce)的鑒(jian)定(ding)(ding)技(ji)術(shu)(shu)，對微生(sheng)物的分型能力很(hen)強，該檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)(shu)主要有16S rDNA測(ce)序技(ji)術(shu)(shu)、PFGE和全基(ji)因組測(ce)序技(ji)術(shu)(shu)等。

　　在蛋白質檢測方面，曾靜介紹說(shuo)，利用飛(fei)行時間(jian)質譜進行微生(sheng)物鑒定(ding)的(de)原理是通過質譜獲得微生(sheng)物特征(zheng)蛋白質分子的(de)“指紋圖譜”，然后與(yu)大容(rong)量(liang)的(de)數據(ju)庫進行對(dui)比，最終實現菌落或(huo)者菌株(zhu)水平上(shang)的(de)鑒定(ding)。質譜鑒定(ding)系統的(de)優勢主要體現在鑒定(ding)速度快，僅(jin)需十(shi)余秒即可完成。

　　在DNA檢(jian)測技(ji)術方面，曾靜分(fen)別就16S rDNA測序技(ji)術、PFGE和全基因組測序技(ji)術做了詳細的闡述。

　　她說道(dao)，16S rDNA基(ji)因是(shi)細(xi)菌核糖體(ti)DNA的(de)(de)(de)(de)一部分，被稱為(wei)(wei)細(xi)菌的(de)(de)(de)(de)“活(huo)化石”，該(gai)基(ji)因進(jin)化速度十(shi)分緩慢(man)，具有生物鐘的(de)(de)(de)(de)特點，已經作(zuo)為(wei)(wei)細(xi)菌系統(tong)發育的(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)基(ji)因，16S rDNA序(xu)列測(ce)(ce)(ce)定是(shi)科研領域(yu)細(xi)菌分類和鑒定的(de)(de)(de)(de)金標(biao)準。目前，常(chang)見的(de)(de)(de)(de)商業(ye)化測(ce)(ce)(ce)序(xu)系統(tong)有針(zhen)對細(xi)菌16S rDNA中(zhong)的(de)(de)(de)(de)500bp保守序(xu)列進(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)(ce)序(xu)、針(zhen)對真菌的(de)(de)(de)(de)28S rDNA的(de)(de)(de)(de)D2基(ji)因區(qu)域(yu)進(jin)行(xing)(xing)測(ce)(ce)(ce)序(xu)等。該(gai)方(fang)法獲得的(de)(de)(de)(de)數據(ju)有利于致病(bing)菌的(de)(de)(de)(de)溯源分析，但是(shi)操(cao)作(zuo)過程(cheng)具有一定的(de)(de)(de)(de)復雜度，耗時較(jiao)(jiao)長，另(ling)外，基(ji)因測(ce)(ce)(ce)序(xu)儀和測(ce)(ce)(ce)序(xu)耗材試(shi)劑的(de)(de)(de)(de)價格(ge)較(jiao)(jiao)貴，因此不利于在應用(yong)層面(mian)進(jin)行(xing)(xing)推(tui)廣。

　　報告(gao)中(zhong)，曾靜對(dui)PFGE闡述道，PFGE(脈沖(chong)場凝膠電(dian)泳)是(shi)一種(zhong)分(fen)離(li)大分(fen)子DNA的(de)方(fang)法。此種(zhong)方(fang)法的(de)原理(li)是(shi)將細菌包埋(mai)于瓊脂塊中(zhong)，用適當的(de)內切酶(mei)在(zai)(zai)原位對(dui)整個(ge)細胞染色體進行酶(mei)切，酶(mei)切片段(duan)在(zai)(zai)特定的(de)電(dian)泳系統中(zhong)通過電(dian)場方(fang)向的(de)不斷交(jiao)替變換和(he)適合的(de)脈沖(chong)時間等條件作(zuo)(zuo)用而得到良好(hao)分(fen)離(li)的(de)方(fang)法。PFGE的(de)分(fen)型(xing)能力極強，可(ke)(ke)區分(fen)菌株水平(ping)的(de)差異，目前被全世界各個(ge)國家普(pu)遍使用。通過PFGE分(fen)型(xing)可(ke)(ke)以對(dui)細菌性(xing)傳染病、食源(yuan)性(xing)致病菌進行監測，同時可(ke)(ke)以進行分(fen)子流行病學的(de)調查，但是(shi)操(cao)作(zuo)(zuo)較(jiao)為繁瑣(suo)，需要較(jiao)高的(de)實驗技(ji)能方(fang)可(ke)(ke)掌握。

　　在全(quan)基因組測序(xu)技(ji)術方面，曾靜(jing)介紹(shao)說(shuo)，該(gai)技(ji)術可以對菌(jun)株(zhu)進行(xing)最為(wei)有效的(de)分(fen)型，即(ji)使(shi)是(shi)16S差異不大的(de)菌(jun)株(zhu)，也(ye)可以通過分(fen)布在整個基因組上的(de)單核(he)苷酸多態性位點(SNP)進行(xing)區分(fen)，是(shi)目(mu)前(qian)分(fen)型能力(li)最為(wei)強(qiang)大的(de)技(ji)術之(zhi)一(yi)。全(quan)基因組測序(xu)用于微(wei)生物鑒定工作的(de)主(zhu)要障礙在于使(shi)用成本高和專業的(de)數據(ju)分(fen)析。

　　最后，曾靜提到(dao)，對(dui)于檢(jian)驗檢(jian)疫工作來說，需(xu)(xu)要根據實(shi)際(ji)情況選擇合適的(de)微(wei)生物(wu)鑒定方法。同時(shi)，為了(le)更快速、更準確的(de)確認病(bing)原(yuan)微(wei)生物(wu)，可能需(xu)(xu)要幾(ji)種(zhong)鑒定方法聯(lian)合使用，例如可以先利用質譜鑒定速度快的(de)優勢迅速判(pan)斷致(zhi)病(bing)菌，然后再(zai)利用分(fen)子生物(wu)學的(de)手(shou)段進行分(fen)型和流行病(bing)學的(de)調查。