一、檢驗方法驗證(zheng)的基(ji)本內容

　　檢驗方法(fa)驗證的(de)基本內(nei)容包(bao)括方案的(de)起草及(ji)審批，檢測儀器的(de)確認。

　　適用性驗(yan)(yan)證(包括準確度(du)試(shi)驗(yan)(yan)、精密度(du)測定、線性范圍試(shi)驗(yan)(yan)、專屬性試(shi)驗(yan)(yan)等(deng))和結(jie)果評價(jia)及批準四個的方面(mian)。

　　二、檢驗方法(fa)驗證的基本步驟

　　首先是(shi)制定驗證方案，然后對大型精(jing)密(mi)儀器(qi)進行確認(ren)，最關鍵(jian)的一步(bu)是(shi)檢(jian)驗方法的適用性試驗，最后是(shi)檢(jian)驗方法評價及批準。

　　1、驗證方案的制定

　　檢驗(yan)方(fang)法的驗(yan)證方(fang)案(an)通常由(you)質量驗(yan)證小(xiao)組提出(chu)。根據產品(pin)的工藝條件、原輔料(liao)化學結(jie)構、中間(jian)體、分解產物查閱有關資(zi)料(liao)，提出(chu)規格標準，確定(ding)檢查項目，規定(ding)雜(za)質限(xian)度，即為質量標準草案(an)。

　　根據質量標(biao)準(zhun)草案(an)確定(ding)檢查(cha)和試(shi)驗范(fan)圍，對檢驗方法(fa)擬定(ding)具體操作步驟(zou)，最(zui)后經有關人員審批方可實施(shi)。

　　2、大型精密儀器的確認

　　分(fen)析測試(shi)中所用的檢(jian)測儀器一般可分(fen)為(wei)三類(lei)：

　　A、普(pu)通儀器(qi)：崩解儀，折光(guang)儀、分析天平(ping)、酸度(du)計、溶點測定儀、電導儀等(deng);

　　B、較精密儀(yi)(yi)器：旋光(guang)儀(yi)(yi)、永停滴定(ding)儀(yi)(yi)、費休氏水(shui)分測定(ding)儀(yi)(yi)、 自動滴定(ding)儀(yi)(yi)、藥(yao)物溶出度(du)儀(yi)(yi)、可見分光(guang)光(guang)度(du)計、電泳儀(yi)(yi)等;

　　C、大型精密儀(yi)器(qi)：紫(zi)外分(fen)光(guang)光(guang)度計、紅(hong)外分(fen)光(guang)光(guang)度計、氣相色譜儀(yi)、高(gao)效液(ye)相色譜儀(yi)、薄層掃描儀(yi)等(deng)。

　　為(wei)了保證(zheng)分析測(ce)試數(shu)據準確可靠，每臺檢(jian)測(ce)儀器在投入正式使用之前(qian)都應進行確認。

　　檢測儀器的確(que)認是檢驗(yan)方法驗(yan)證的基礎，應在其(qi)它驗(yan)證試驗(yan)開始(shi)之前(qian)首先(xian)完(wan)成(cheng)。

　　檢測儀(yi)器確認(ren)工作內容(rong)應根(gen)據儀(yi)器類型。技術性(xing)能而定(ding)，通常包括(kuo)：安裝確認(ren)、校正、適用性(xing)預試驗(yan)和(he)再確認(ren)。

　　3、校正

　　校正是儀器確認及檢驗(yan)方法驗(yan)證中的一個重要環節，應當在(zai)驗(yan)證試(shi)驗(yan)以前(qian)進行校正。紫外分光光度(du)計校正包括波長校正、吸收度(du)測(ce)試(shi)、準確度(du)測(ce)試(shi)、雜散光檢查。

　　氣相色(se)譜(pu)儀與高效液(ye)相色(se)譜(pu)儀均要求做(zuo)系(xi)統(tong)適(shi)用性試驗。在(zai)規定的色(se)譜(pu)條(tiao)件下測定色(se)譜(pu)柱的最小理論(lun)塔(ta)板數。分離度和拖(tuo)尾(wei)因子，并規定變(bian)異(yi)系(xi)數應不大(da)于2%。

　　對(dui)于化學(xue)檢驗中使用的計量儀(yi)器包括容量瓶、移液管(guan)、滴(di)定管(guan)、分析天平亦均應校正。

　　4、適用性預試驗

　　儀器(qi)的安裝確(que)認(ren)完成以后，在其功能試驗符合要求(qiu)的情(qing)況下，應用標(biao)準品(pin)(pin)或對(dui)照品(pin)(pin)對(dui)其進行適用性檢查，以確(que)認(ren)儀器(qi)是否符合使用要求(qiu)。

　　例如對(dui)熔(rong)點測定儀的(de)適用(yong)性預試驗(yan)是采用(yong)已知(zhi)溶點的(de)甲硝(xiao)唑做試驗(yan)，測試結(jie)果與(yu)已知(zhi)熔(rong)點比較。

　　紫(zi)外分光光度計可用(yong)已知含(han)量(liang)的某標(biao)準品試(shi)驗，測得結果與已知數值(zhi)對比(bi)，確定儀(yi)器是否符(fu)合使用(yong)要求。

　　在完成上(shang)述(shu)各(ge)項(xiang)試驗(yan)工(gong)作的同(tong)時，應(ying)做好相應(ying)的文件記錄等(deng)資料歸(gui)檔(dang)工(gong)作，每一臺儀器均(jun)應(ying)有一套完整的檔(dang)案(an)資料。

　　5、再確認

　　為(wei)了(le)確(que)保儀(yi)器處于良好的(de)使用(yong)狀態，對于一臺新購買的(de)儀(yi)器在(zai)確(que)認工(gong)作結束以后(hou)，應根據儀(yi)器的(de)類(lei)別。確(que)認的(de)經驗制(zhi)定(ding)再確(que)認的(de)計(ji)劃(hua)。

　　再(zai)確認的時(shi)間間隔和(he)內容(rong)要根據儀(yi)器類別(bie)和(he)使用情況決定，一(yi)般是3個月、6個月或1年。

　　儀器(qi)再確(que)認(ren)的內容通常(chang)包括(kuo)線路連(lian)接、附件備(bei)品消耗檢查、清潔工作、功能試(shi)驗、工作日(ri)記等(deng)，其中重(zhong)點(dian)安裝確(que)認(ren)中的功能試(shi)驗。

　　三、檢驗方法(fa)的適(shi)用性驗證

　　藥(yao)品質量標準分(fen)析方法(fa)驗證(zheng)的(de)(de)目(mu)的(de)(de)是證(zheng)明采用的(de)(de)方法(fa)適合于相應的(de)(de)檢測(ce)要求。

　　在起草(cao)藥品質(zhi)量(liang)標(biao)準時，分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)需(xu)經驗證：在藥物生(sheng)產方(fang)法(fa)(fa)變更、制(zhi)劑的組(zu)分(fen)變更、原分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)進行(xing)修訂(ding)時，則(ze)質(zhi)量(liang)標(biao)準分(fen)析方(fang)法(fa)(fa)也需(xu)進行(xing)驗證。

　　方法(fa)驗證(zheng)過程和(he)結果均應記載在藥(yao)品標準起草或修訂(ding)說明中。

　　根(gen)據《中國藥(yao)典(dian)》 (2010版)附錄XIXA的原則(ze)要求，檢驗方(fang)法(fa)的驗證可分為(wei)三(san)種(zhong)情(qing)況處(chu)理;

　　1、無需驗證的方法。

　　如(ru)藥(yao)典(包括USP、EP、CP、JP等各國藥(yao)典)的(de)方法，一般只做系(xi)(xi)統(tong)適用性試驗，以(yi)確認系(xi)(xi)統(tong)是否(fou)(fou)符合要求(qiu)(主要指(zhi)儀器穩定性及柱(zhu)的(de)分離(li)度是否(fou)(fou)達標(biao))。

　　2、對比法。

　　已在參(can)比實驗(yan)(yan)室(shi)(shi)驗(yan)(yan)證過(guo)的分析(xi)方(fang)(fang)法(fa)(fa)，可用對比試(shi)驗(yan)(yan)的方(fang)(fang)法(fa)(fa)來確認(ren)方(fang)(fang)法(fa)(fa)的可靠性(xing)(xing)，即將本實驗(yan)(yan)室(shi)(shi)與(yu)參(can)比實驗(yan)(yan)室(shi)(shi)用同一方(fang)(fang)法(fa)(fa)對同批(pi)(pi)樣品所測數據進(jin)行(xing)比較(如至少取五個批(pi)(pi)號，每(mei)批(pi)(pi)重(zhong)復(fu)測定五次)，判(pan)斷方(fang)(fang)法(fa)(fa)在本實驗(yan)(yan)室(shi)(shi)的可行(xing)性(xing)(xing)。

　　如有差異需(xu)查明原因或設計方(fang)案(an)，對方(fang)法進行再驗證。

　　3、需進行系統驗證的方法。

　　四、檢驗(yan)方法的評價及批(pi)準

　　安裝確認(ren)及適(shi)用(yong)性試(shi)驗(yan)(yan)結束后(hou)，應將(jiang)試(shi)驗(yan)(yan)數(shu)據資料進行匯總分析。對檢驗(yan)(yan)方法作出正確的評價，驗(yan)(yan)證報告的說明及結論(lun)部分應簡明扼要。

　　試(shi)驗中的(de)主(zhu)要(yao)偏差應有適當解釋。然后，報主(zhu)管領導審批(pi)。檢(jian)(jian)驗方法(fa)驗證(zheng)(zheng)的(de)最終產物是一個(ge)經過驗證(zheng)(zheng)的(de)方法(fa)—根據驗證(zheng)(zheng)的(de)結果(guo)制訂(ding)的(de)由有關領導批(pi)準的(de)檢(jian)(jian)驗方法(fa)。

　　五(wu)、如何詳(xiang)細計算檢出限?

　　在如何正確或準確地估(gu)算(suan)檢出限的問題上,國際分(fen)析(xi)(xi)(xi)界一(yi)(yi)直存有爭議。檢出限的特(te)殊意義(yi)在于可(ke)以對一(yi)(yi)個(ge)給定的分(fen)析(xi)(xi)(xi)方法在低(di)(di)濃(nong)度水平(ping)的檢測(ce)(ce)能(neng)(neng)力進(jin)行準確地評(ping)估(gu)，而(er)考察一(yi)(yi)個(ge)分(fen)析(xi)(xi)(xi)方法在低(di)(di)濃(nong)度范圍(wei)的檢測(ce)(ce)性能(neng)(neng)，可(ke)以基于不(bu)同的角度或不(bu)同的側重點,如可(ke)以從最小(xiao)信號值與儀器噪音之比來考察，從方法測(ce)(ce)定空白(bai)的平(ping)均波動性來統計估(gu)算(suan),也可(ke)以根據分(fen)析(xi)(xi)(xi)方法校(xiao)準曲線的偏差特(te)性來定量(liang)估(gu)算(suan)等(deng)等(deng)。

　　檢出限(xian)是評(ping)價一(yi)個分析(xi)方法及測試儀器性能的重要(yao)指標,所(suo)謂“檢出”是指定(ding)(ding)性檢出，即判定(ding)(ding)樣(yang)品中存在(zai)有濃度高于空白的待測物質。

　　ACS(美國化學(xue)學(xue)會)對(dui)這一(yi)定義作了更簡明(ming)的概括:檢出(chu)限是一(yi)個分析(xi)方法能夠可靠地檢測出(chu)被分析(xi)物的最(zui)低濃度。

　　1、檢測限(limit of detection, LOD)定義:

　　在(zai)樣品(pin)(pin)中(zhong)能檢(jian)出的(de)(de)(de)被測(ce)(ce)組分的(de)(de)(de)最低濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)(量)稱為檢(jian)測(ce)(ce)限(xian)(xian)，即產生(sheng)信號(峰(feng)高)為基線噪音(yin)標準差k倍時(shi)的(de)(de)(de)樣品(pin)(pin)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)，一(yi)般為信噪比(S/N)2:1或3:1時(shi)的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)，對其測(ce)(ce)定的(de)(de)(de)準確度(du)(du)和精密度(du)(du)沒有確定的(de)(de)(de)要(yao)求。目前，一(yi)般將(jiang)檢(jian)測(ce)(ce)限(xian)(xian)定義(yi)為信噪比(S/N)3:1時(shi)的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)(nong)度(du)(du)。

　　2、計算公式為：

　　D=3N/S (1)

　　式中：N——噪(zao)音; S——檢測器靈敏(min)度;D——檢測限

　　而靈敏度的(de)計算(suan)公式(shi)為：

　　S=I/Q (2)

　　式中：S——靈敏度(du);I——信(xin)號(hao)響應值(zhi);Q——進樣量

　　將式(shi)(1)和式(shi)(2)合并，得到下(xia)式(shi)：

　　D=3N×Q/I (3)

　　式中：Q——進(jin)樣量;N——噪(zao)音;I——信號響應值。I/N即為該(gai)進(jin)樣量下的信噪(zao)比(S/N)，該(gai)信噪(zao)比可(ke)通過工作(zuo)站(zhan)對圖譜進(jin)行自動分(fen)析獲(huo)得，一般的色譜或(huo)質譜工作(zuo)站(zhan)都可(ke)進(jin)行信噪(zao)比分(fen)析計算(suan)(suan)。這(zhe)樣檢測限的計算(suan)(suan)方(fang)法就變得非常(chang)方(fang)便了。

　　3、計算方法：

　　實際計(ji)算時，檢出限(xian)有(you)2種(zhong)表示方(fang)法：一種(zhong)是進樣瓶中樣品(pin)檢測限(xian)，一種(zhong)是針對原始(shi)樣品(pin)的方(fang)法檢出限(xian)。

　　A、對第一種檢(jian)測(ce)限，只要知道進(jin)樣量和信噪比即可計(ji)算。如(ru)進(jin)樣瓶(ping)中(zhong)樣品濃度為1 mg/L,在(zai)此濃度下的信噪比為300(由工作(zuo)站分析獲得)，則(ze)其(qi)檢(jian)測(ce)限為：D =(3×1 mg L-1)/300 = 0.01 mg/L。也(ye)可用(yong)絕對進(jin)樣量表示，若(ruo)進(jin)樣體積為10 ul，則(ze)其(qi)檢(jian)測(ce)限為：D = 3×(1 mgL-1×10 ul)/300 = 0.1 ng。

　　B、對第二種表示(shi)方(fang)法，需(xu)同時考慮(lv)原始樣(yang)品(pin)(pin)的(de)取(qu)樣(yang)量和(he)提(ti)取(qu)樣(yang)品(pin)(pin)的(de)定容(rong)體積(ji)。仍(reng)按前述樣(yang)品(pin)(pin)計算，若(ruo)取(qu)樣(yang)量為(wei)5克，最后(hou)定容(rong)體積(ji)為(wei)5 mL，則方(fang)法檢測限為(wei)：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。

　　即當原始樣(yang)(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)待檢物質的(de)濃度為0.01mg/kg時(shi)，若取樣(yang)(yang)量為5g,樣(yang)(yang)品(pin)經前處理(li)后定(ding)容體積(ji)為5mL時(shi),進樣(yang)(yang)瓶中(zhong)(zhong)樣(yang)(yang)品(pin)的(de)濃度可(ke)達(da)0.01mg/L(假定(ding)回收率(lv)為100%),此(ci)時(shi)，在(zai)其它(ta)給定(ding)的(de)分析條件下，能產生(sheng)3倍噪聲(sheng)強度的(de)信號。在(zai)實際檢測工作中(zhong)(zhong)，第二種表示方法(fa)更(geng)為常見。

　　4、注意事項

　　由式(shi)(3)可見，信噪比(bi)的大小直接關(guan)系(xi)到檢測限(xian)的大小。信噪比(bi)計(ji)算(suan)方(fang)法的不同(tong)(tong)，其比(bi)值大小有很大不同(tong)(tong)，這與計(ji)算(suan)信噪比(bi)時基線噪聲峰(feng)值的定義方(fang)式(shi)有關(guan)，一般有三種不同(tong)(tong)的定義：

　　A、峰(feng)/峰(feng)(peak to peak)信噪(zao)比，用某一段基(ji)線噪(zao)聲的(de)平(ping)均高度;

　　B、峰/半峰(half peak to peak)信噪(zao)比, 用某一(yi)段基線(xian)噪(zao)聲(sheng)平均高度的1/2;

　　C、均方根(RMS)信噪比，用(yong)某一段基線噪聲的均方根值計(ji)算。

　　除此(ci)之外，信噪(zao)比的(de)計(ji)算(suan)結果還和所取(qu)噪(zao)聲的(de)位置有(you)很(hen)大關系，取(qu)信號(hao)哪一側(ce)基線(xian)的(de)噪(zao)聲，取(qu)多(duo)長一段基線(xian)上的(de)噪(zao)聲，計(ji)算(suan)結果都很(hen)不完全相同(tong)，有(you)時相差甚遠。一般(ban)多(duo)取(qu)樣品峰(feng)兩側(ce)的(de)噪(zao)聲峰(feng)值計(ji)算(suan)。

　　5、檢出限的確定

　　A、《全球環境監測(ce)(ce)系統水(shui)監測(ce)(ce)操作指南》中規(gui)定：給定置信水(shui)平為(wei)95%時，樣(yang)品測(ce)(ce)定值與零濃度樣(yang)品的(de)測(ce)(ce)定值有(you)顯(xian)著性(xing)差異即為(wei)檢出限：

　　L = 4.6Sb

　　式中：L——方法的最低檢(jian)出濃度。

　　Sb ——測(ce)定次(ci)(ci)數為n次(ci)(ci)的空白平行(xing)測(ce)定(批內)標準差(重復測(ce)定20次(ci)(ci)以上)。

　　B、國際純粹(cui)和應用(yong)化學(xue)聯合會(IUPAC)規定(ding)對各種(zhong)光(guang)學(xue)分析方法(fa)，可(ke)用(yong)下式計算：

　　L = KSb/S

　　L——方法的(de)最(zui)低(di)檢出濃度

　　Sb——空白多次測量的標準偏(pian)差(吸(xi)光度(du));

　　S ——方法的靈敏(min)度(du)(即校準曲線的斜率(lv))

　　為了(le)評估 ，空白測定次(ci)數必(bi)須足夠(gou)多，最好能測20次(ci)。國際純粹和應用(yong)化(hua)學聯合會(hui)極力提倡取k值為3，一般來說，取 相應的置信(xin)水平(ping)大約為90%。

　　若 =0，并不意味著(zhu) ，或檢出限(xian)無限(xian)小。這(zhe)時需配制一個(ge)(ge)濃度略大于零濃度的試樣系列(能產生一個(ge)(ge)可測信號值)代(dai)替(ti)全程序(xu)空(kong)白試驗，求出其標準偏(pian)差，用(yong)來代(dai)替(ti) 。

　　此外，有時為(wei)(wei)了工作方(fang)便和便于比(bi)較，也規定一個大家能接受的信號值作為(wei)(wei)檢出限，如(ru)分光(guang)光(guang)度(du)(du)(du)法中，規定吸光(guang)度(du)(du)(du)為(wei)(wei)0.010所對應的濃(nong)度(du)(du)(du)即為(wei)(wei)檢出限L。

　　C、 美國EPA SW—846規定(ding)方法中的檢出(chu)限為：

　　L=3.143Sb

　　D、某些分光光度(du)法是以吸(xi)光度(du)(扣除空(kong)白(bai))為0.010相對應的(de)(de)濃(nong)度(du)值或絕對量為檢出限，這是一(yi)種實驗室間的(de)(de)協(xie)定方案。

　　E、氣相(xiang)色譜法：檢測器(qi)恰(qia)能產(chan)生與噪音相(xiang)區別的響(xiang)應(ying)信號時所需進入色譜的物質最小量為(wei)檢出限，一(yi)般為(wei)噪音的二倍。

　　F、離(li)子(zi)選擇電極(ji)法(fa)：當校準曲線(xian)的直線(xian)部分外延(yan)的延(yan)長線(xian)與(yu)通過空白電位且(qie)平行于(yu)濃度(du)(du)軸的直線(xian)相(xiang)交時，其(qi)交點所對應的濃度(du)(du)值即為(wei)該離(li)子(zi)色(se)譜所對電極(ji)法(fa)的檢出限。

　　由測得的(de)空白(bai)值(zhi)計算(suan)出的(de)L值(zhi)不應大(da)于分析方法規定的(de)最低檢(jian)出濃度值(zhi)，如(ru)大(da)于方法規定值(zhi)時(shi)，必(bi)須尋找原因降低空白(bai)值(zhi)，重新(xin)測定計算(suan)至合格(ge)。

　　6、校正曲線繪制：

　　A、按分析方(fang)法步驟，通過實測濃(nong)度和儀器信號(hao)值的(de)直(zhi)線(xian)關系，確(que)定(ding)實驗室條(tiao)件下的(de)測定(ding)上限(xian)。當測定(ding)上限(xian)低于方(fang)法的(de)檢(jian)測上限(xian)時，只能用實測的(de)直(zhi)線(xian)范圍。

　　B、繪(hui)制(zhi)校正曲(qu)線的分析(xi)步(bu)驟(zou)應與樣品(pin)分析(xi)相(xiang)同，并且不少于5個濃(nong)度值。

　　C、校正(zheng)(zheng)曲線繪制與(yu)每批(pi)測定(ding)樣(yang)品同時進行，對某(mou)些分析方(fang)法的(de)校正(zheng)(zheng)曲線的(de)斜率(lv)穩定(ding)，批(pi)間(jian)誤差較(jiao)小，使用原制校正(zheng)(zheng)曲線時，應與(yu)樣(yang)品同時測定(ding)2份中等濃度標樣(yang)和2份空白的(de)平行樣(yang)。

　　測得標準(zhun)的(de)濃度(du)(減去空(kong)白(bai))值(zhi)與原(yuan)校正(zheng)曲線相對應的(de)濃度(du)值(zhi)的(de)相對偏差，分光光度(du)應小于(yu)(yu)5%;原(yuan)子吸(xi)收(shou)法(fa)應小于(yu)(yu)10%，否(fou)則(ze)重新(xin)制作校正(zheng)曲線。

　　六、小結(jie)

　　最后還要(yao)(yao)(yao)特(te)別(bie)強(qiang)調，檢出限(xian)(xian)和(he)(he)測定(ding)下限(xian)(xian)是兩(liang)(liang)個(ge)(ge)不(bu)同(tong)(tong)的(de)概(gai)念(nian)(nian)，它們是評價一(yi)個(ge)(ge)分析(xi)方(fang)法(fa)及測試儀(yi)器性(xing)能的(de)重要(yao)(yao)(yao)指標，檢出限(xian)(xian)是一(yi)個(ge)(ge)定(ding)性(xing)概(gai)念(nian)(nian)，而(er)測定(ding)下限(xian)(xian)是一(yi)個(ge)(ge)定(ding)量(liang)概(gai)念(nian)(nian)，搞清楚兩(liang)(liang)者概(gai)念(nian)(nian)和(he)(he)相互關系，可提(ti)高色譜(pu)分析(xi)中檢測結果的(de)準確(que)性(xing)和(he)(he)可靠性(xing)，特(te)別(bie)在痕量(liang)分析(xi)中，檢出限(xian)(xian)和(he)(he)測定(ding)下限(xian)(xian)的(de)確(que)定(ding)對(dui)于分析(xi)方(fang)法(fa)的(de)選(xuan)擇具(ju)有(you)重要(yao)(yao)(yao)意義(yi)，同(tong)(tong)樣的(de)，對(dui)于實驗室質量(liang)控制也具(ju)有(you)很(hen)重要(yao)(yao)(yao)的(de)意義(yi)。